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폐 낭성 섬유증 치료를 위한 유전자 벡터는 말초 폐 전달이 치료 효과가 없기 때문에 전도성 기도를 표적으로 해야 합니다.바이러스 형질도입의 효율성은 운반체의 체류 시간과 직접적으로 관련이 있습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 전달액은 흡입 시 자연적으로 폐포로 확산되며 어떤 형태의 치료용 입자도 점액 섬모 수송에 의해 빠르게 제거됩니다.호흡기에서 유전자 운반체의 체류 시간을 연장하는 것은 중요하지만 달성하기 어렵습니다.기도 표면으로 향할 수 있는 캐리어 결합 자기 입자는 지역 타겟팅을 향상시킬 수 있습니다.생체 내 이미징의 문제로 인해 인가된 자기장이 있는 기도 표면에서 이러한 작은 자성 입자의 거동은 잘 이해되지 않습니다.이 연구의 목적은 싱크로트론 이미징을 사용하여 생체 내에서 단일 및 벌크 입자의 역학 및 행동 패턴을 연구하기 위해 마취된 쥐의 기관에서 일련의 자성 입자의 움직임을 생체 내에서 시각화하는 것이었습니다.그런 다음 자기장이 있는 상태에서 렌티바이러스 자성 입자를 전달하면 쥐의 기관에서 전달 효율이 증가하는지 여부도 평가했습니다.싱크로트론 X선 이미징은 시험관 내 및 생체 내 고정 및 이동 자기장에서 자성 입자의 거동을 보여줍니다.입자는 자석을 사용하여 살아있는 기도의 표면을 가로질러 쉽게 끌 수 없지만 운송 중에 침전물은 자기장이 가장 강한 시야에 집중됩니다.렌티바이러스 자성 입자가 자기장이 있는 상태에서 전달되었을 때 형질도입 효율도 6배 증가했습니다.종합하면, 이러한 결과는 렌티바이러스 자기 입자와 자기장이 생체 내 전도성 기도에서 유전자 벡터 표적화 및 형질도입 수준을 개선하는 데 유용한 접근법일 수 있음을 시사합니다.
낭포성 섬유증(CF)은 CF 막전도 조절자(CFTR)라는 단일 유전자의 변이로 인해 발생합니다.CFTR 단백질은 낭포성 섬유증 발병의 주요 부위인 기도를 포함하여 전신의 많은 상피 세포에 존재하는 이온 채널입니다.CFTR의 결함은 비정상적인 수분 수송, 기도 표면의 탈수, 기도 표면 유체층(ASL) 깊이 감소로 이어집니다.또한 흡입된 입자 및 병원균의 기도를 청소하는 점액 섬모 수송(MCT) 시스템의 기능을 손상시킵니다.우리의 목표는 CFTR 유전자의 정확한 복사본을 전달하고 ASL, MCT 및 폐 건강을 개선하기 위한 렌티바이러스(LV) 유전자 요법을 개발하고 이러한 매개변수를 생체 내에서 측정할 수 있는 새로운 기술을 계속 개발하는 것입니다1.
좌심실 벡터는 치료 유전자를 기도 기저 세포(기도 줄기 세포)에 영구적으로 통합할 수 있기 때문에 주로 낭포성 섬유증 유전자 치료의 주요 후보 중 하나입니다.이것은 낭포성 섬유증과 관련된 기능적 유전자 교정 기도 표면 세포로 분화하여 정상적인 수화 및 점액 제거를 회복할 수 있기 때문에 중요합니다.LV 벡터는 CF의 폐 침범이 시작되는 곳이므로 전도성 기도에 대해 지시되어야 합니다.벡터를 폐 깊숙이 전달하면 폐포 변환이 발생할 수 있지만 낭포성 섬유증에는 치료 효과가 없습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 체액은 출산 후 흡입될 때 자연적으로 폐포로 이동하고3,4 치료용 입자는 MCT에 의해 구강으로 빠르게 배출됩니다.LV 형질도입의 효율성은 벡터가 세포 흡수를 허용하기 위해 표적 세포에 가깝게 유지되는 시간과 직접적인 관련이 있습니다. "체류 시간" 5은 점액 및 MCT 입자의 공동 흡수뿐만 아니라 일반적인 지역 기류에 의해 쉽게 단축됩니다.낭포성 섬유증의 경우 기도에서 좌심실 체류 시간을 연장하는 능력은 이 영역에서 높은 수준의 변환을 달성하는 데 중요하지만 지금까지는 도전적이었습니다.
이 장애물을 극복하기 위해 LV 자성 입자(MP)가 두 가지 보완적인 방법으로 도움이 될 수 있다고 제안합니다.첫째, 그들은 자석에 의해 기도 표면으로 안내되어 표적화를 개선하고 유전자 운반체 입자가 기도의 올바른 영역에 있도록 도울 수 있습니다.및 ASL) 세포층 6으로 이동합니다. MP는 세포막에 부착되거나 각각의 세포 표면 수용체에 결합하고 종양 부위에 축적되는 항체, 화학 요법 약물 또는 기타 작은 분자에 결합할 때 표적 약물 전달 수단으로 널리 사용됩니다. 정전기의 존재.암 치료를 위한 자기장 7. 다른 "고열" 방법은 진동하는 자기장에 노출되었을 때 MP를 가열하여 종양 세포를 죽이는 것을 목표로 합니다.DNA의 세포로의 전달을 향상시키기 위해 자기장이 형질감염제로 사용되는 자기 형질감염의 원리는 일반적으로 형질도입이 어려운 세포주에 대해 다양한 비바이러스 및 바이러스 유전자 벡터를 사용하여 시험관 내에서 사용됩니다. ..체외에서 정자기장의 존재 하에 인간 기관지 상피 세포주로 LV MP를 전달하는 LV 자기형질감염의 효율이 확립되어 LV 벡터 단독에 비해 형질도입 효율이 186배 증가했습니다.LV MT는 또한 낭포성 섬유증의 체외 모델에 적용되었으며, 여기서 자기 형질감염은 낭포성 섬유증 가래10의 존재 시 공기-액체 인터페이스 배양에서 LV 변환을 20배 증가시켰습니다.그러나 생체 내 기관 자기형질감염은 상대적으로 거의 주목을 받지 못했으며 특히 폐16,17에서 소수의 동물 연구에서만 평가되었습니다.그러나 낭포성 섬유증의 폐 치료에서 자기 형질감염의 가능성은 분명합니다.Tanet al.(2020)은 "자성 나노입자의 효과적인 폐 전달에 대한 검증 연구는 낭포성 섬유증 환자의 임상 결과를 개선하기 위한 미래의 CFTR 흡입 전략을 위한 길을 열 것"이라고 말했습니다6.
인가된 자기장이 있는 상태에서 기도 표면의 작은 자성 입자의 거동은 시각화하고 연구하기 어렵기 때문에 잘 이해되지 않습니다.다른 연구에서 우리는 ASL18 깊이 및 MCT19 거동의 미세한 생체 내 변화의 비침습적 이미징 및 정량화를 위한 PB-PCXI(Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging) 방법을 개발하여 가스 채널 표면 수화를 직접 측정했습니다. 조기 지표 치료 효과로 사용됩니다.또한 당사의 MCT 점수 매기기 방법은 PB-PCXI21에서 볼 수 있는 MCT 마커로 알루미나 또는 고굴절률 유리로 구성된 10–35 µm 직경의 입자를 사용합니다.두 방법 모두 MP를 포함한 다양한 입자 유형을 이미징하는 데 적합합니다.
높은 공간적 및 시간적 해상도로 인해 PB-PCXI 기반 ASL 및 MCT 분석은 MP 유전자 전달 방법을 이해하고 최적화하는 데 도움이 되는 생체 내 단일 및 벌크 입자의 역학 및 행동 패턴을 연구하는 데 매우 적합합니다.여기서 우리가 사용하는 접근법은 SPring-8 BL20B2 빔라인을 사용한 연구를 기반으로 합니다. 여기에서 더미 벡터를 생쥐의 비강 및 폐 기도로 전달한 후 유체 이동을 시각화하여 관찰된 이기종 유전자 발현 패턴을 설명하는 데 도움을 주었습니다. 우리 유전자에서.3.4의 담체 용량을 사용한 동물 연구.
이 연구의 목적은 PB-PCXI 싱크로트론을 사용하여 살아있는 쥐의 기관에서 일련의 MP의 생체 내 움직임을 시각화하는 것이었습니다.이러한 PB-PCXI 이미징 연구는 MP 시리즈, 자기장 강도 및 위치를 테스트하여 MP 이동에 미치는 영향을 확인하도록 설계되었습니다.우리는 외부 자기장이 전달된 MF가 목표 영역에 머무르거나 이동하는 데 도움이 될 것이라고 가정했습니다.이러한 연구를 통해 우리는 증착 후 기관에 남아 있는 입자의 양을 최대화하는 자석 구성을 결정할 수 있었습니다.두 번째 일련의 연구에서 우리는 이 최적의 구성을 사용하여 기도 표적화의 맥락에서 LV-MP의 전달이 증가된 LV 변환 효율..
모든 동물 연구는 애들레이드 대학교(M-2019-060 및 M-2020-022) 및 SPring-8 싱크로트론 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.실험은 ARRIVE의 권장 사항에 따라 수행되었습니다.
모든 x-선 이미지는 이전에 설명한 것과 유사한 설정을 사용하여 일본의 SPring-8 싱크로트론의 BL20XU 빔라인에서 촬영되었습니다.간단히 말해, 실험 상자는 싱크로트론 저장 고리에서 245m 떨어진 곳에 위치했습니다.0.6m의 샘플-검출기 거리가 입자 이미징 연구에 사용되고 0.3m는 생체 내 이미징 연구에 사용되어 위상차 효과를 생성합니다.25keV의 에너지를 가진 단색 빔이 사용되었습니다.이미지는 sCMOS 검출기에 연결된 고해상도 X선 변환기(SPring-8 BM3)를 사용하여 획득했습니다.변환기는 10µm 두께의 섬광체(Gd3Al2Ga3O12)를 사용하여 X선을 가시광선으로 변환한 다음 ×10(NA 0.3) 현미경 대물렌즈를 사용하여 sCMOS 센서로 보냅니다.sCMOS 검출기는 배열 크기가 2048 × 2048 픽셀이고 원시 픽셀 크기가 6.5 × 6.5 μm인 Orca-Flash4.0(Hamamatsu Photonics, 일본)이었습니다.이 설정은 0.51µm의 유효 등방성 픽셀 크기와 약 1.1mm × 1.1mm의 시야를 제공합니다.100ms의 노출 시간은 기도 내부 및 외부의 자성 입자의 신호 대 잡음비를 최대화하면서 호흡으로 인한 운동 아티팩트를 최소화하기 위해 선택되었습니다.생체 내 연구를 위해 X선 경로에 빠른 X선 셔터를 배치하여 노출 사이에 X선 빔을 차단하여 방사선 선량을 제한했습니다.
LV 배지는 BL20XU 이미징 챔버가 Biosafety Level 2 인증을 받지 않았기 때문에 모든 SPring-8 PB-PCXI 이미징 연구에 사용되지 않았습니다.대신, 우리는 크기, 재료, 철 농도 및 응용 분야의 범위를 다루는 두 개의 상용 공급업체로부터 특성이 잘 알려진 다양한 MP를 선택했습니다. 살아있는 항공.표면.MP의 크기는 0.25에서 18 µm까지 다양하며 다양한 재료로 만들어지지만(표 1 참조) MP의 자성 입자 크기를 포함한 각 샘플의 구성은 알려져 있지 않습니다.당사의 광범위한 MCT 연구 19, 20, 21, 23, 24를 기반으로 MP 이동의 향상된 가시성을 확인하기 위해 연속 프레임을 빼서 기관 기도 표면에서 5μm까지 MP를 볼 수 있을 것으로 예상합니다.0.25 µm의 단일 MP는 이미징 장치의 해상도보다 작지만 PB-PCXI는 증착 후 증착되는 표면 액체의 체적 대비와 움직임을 감지할 것으로 예상됩니다.
테이블의 각 MP에 대한 샘플입니다.1은 내부 직경이 0.63 mm인 20 μl 유리 모세관(Drummond Microcaps, PA, USA)에서 준비되었습니다.미립자 입자는 물에서 사용할 수 있는 반면 CombiMag 입자는 제조업체의 독점 액체에서 사용할 수 있습니다.각 튜브는 액체(약 11µl)로 절반이 채워지고 샘플 홀더에 배치됩니다(그림 1 참조).유리 모세관은 이미징 챔버의 스테이지에 각각 수평으로 배치되고 액체의 가장자리에 배치되었습니다.잔류량이 1.17T인 희토류, 네오디뮴, 철 및 붕소(NdFeB)(N35, 카탈로그 번호 LM1652, Jaycar Electronics, 호주)로 만든 직경 19mm(길이 28mm) 니켈 쉘 자석을 별도의 전송 테이블을 달성하기 위해 렌더링 중에 위치를 원격으로 변경합니다.X선 이미징은 자석이 샘플 위 약 30mm에 위치할 때 시작되고 이미지는 초당 4프레임으로 획득됩니다.이미징하는 동안 자석을 유리 모세관(약 1mm 거리)에 가깝게 가져간 다음 튜브를 따라 이동하여 전계 강도와 위치의 영향을 평가했습니다.
xy 샘플의 변환 단계에서 유리 모세관에 MP 샘플을 포함하는 체외 이미징 설정.X선 빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시됩니다.
MP의 체외 가시성이 확립되면 야생형 암컷 Wistar 알비노 쥐(~12주, ~200g)에서 생체 내에서 MP의 하위 집합을 테스트했습니다.메데토미딘 0.24mg/kg(Domitor®, Zenoaq, 일본), 미다졸람 3.2mg/kg(Dormicum®, Astellas Pharma, 일본) 및 부토파놀 4mg/kg(Vetorphale®, Meiji Seika).래트를 복강내 주사에 의해 Pharma(Japan) 혼합물로 마취시켰다.마취 후 기관 주변의 털을 제거하고 기관내 튜브(ET; 16 Ga 정맥 캐뉼라, Terumo BCT)를 삽입하고 열 가방이 포함된 맞춤형 이미징 플레이트에 누운 자세로 고정하여 영상을 준비했습니다. 체온을 유지하기 위해.22. 그런 다음 그림 2a에 표시된 대로 이미징 플레이트를 이미징 상자의 샘플 스테이지에 약간의 각도로 부착하여 기관을 X-레이 이미지에 수평으로 정렬했습니다.
(a) SPring-8 이미징 장치의 생체 내 이미징 설정, 빨간색 점선으로 표시된 X선 빔 경로.(b,c) 직각으로 장착된 두 대의 IP 카메라를 사용하여 기관 자석 위치 파악을 원격으로 수행했습니다.화면의 이미지 왼쪽에는 헤드를 고정하는 와이어 루프와 ET 튜브 내부에 설치된 전달 캐뉼라가 보입니다.
100µl 유리 주사기를 사용하는 원격 제어 주사기 펌프 시스템(UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL)을 30Ga 바늘을 사용하여 PE10 튜브(0.61mm OD, 0.28mm ID)에 연결했습니다.기관내관을 삽입할 때 팁이 기관의 올바른 위치에 있는지 확인하기 위해 튜브에 표시를 합니다.마이크로 펌프를 사용하여 주사기 플런저를 제거하고 튜브의 끝을 전달될 MP 샘플에 담급니다.그런 다음 로드된 전달 튜브를 기관 내 튜브에 삽입하여 예상되는 인가 자기장의 가장 강한 부분에 팁을 배치했습니다.이미지 획득은 Arduino 기반 타이밍 박스에 연결된 호흡 감지기를 사용하여 제어되었으며 모든 신호(예: 온도, 호흡, 셔터 열림/닫힘 및 이미지 획득)는 Powerlab 및 LabChart(AD Instruments, Sydney, Australia)를 사용하여 기록되었습니다. 22 촬영할 때 하우징을 사용할 수 없을 때 두 대의 IP 카메라(Panasonic BB-SC382)를 서로 약 90°로 배치하고 촬영하는 동안 기관에 대한 자석의 위치를 ​​제어하는 ​​데 사용했습니다(그림 2b, c).모션 아티팩트를 최소화하기 위해 말기 호흡 흐름 안정기 동안 호흡당 하나의 이미지를 획득했습니다.
자석은 이미징 본체 외부에 원격으로 위치할 수 있는 두 번째 스테이지에 부착됩니다.기관 위 약 30°의 각도로 배치(구성은 그림 2a 및 3a에 표시됨);하나는 동물 위의 자석이고 다른 하나는 아래에 있으며, 극은 유인용으로 설정되어 있습니다(그림 3b)., 동물 위의 자석 1개와 아래 1개 자석, 극이 반발용으로 설정됨(그림 3c), 기관 위와 수직인 자석 1개(그림 3d).동물과 자석을 설정하고 테스트 중인 MP를 주사기 펌프에 로드한 후 이미지 수집 시 4 μl/초의 속도로 50 μl의 용량을 전달합니다.그런 다음 이미지를 계속 획득하면서 자석을 기관을 따라 또는 가로질러 앞뒤로 움직입니다.
생체 내 이미징을 위한 자석 구성 (a) 약 30°의 각도로 기관 위의 자석 1개, (b) 인력을 위해 구성된 2개의 자석, (c) 반발을 위해 구성된 2개의 자석, (d) 위의 자석 1개는 기관.관찰자는 기관을 통해 입에서 폐까지 내려다 보았고 X-선 빔은 쥐의 왼쪽을 통과하여 오른쪽으로 나갔다.자석은 기도 길이를 따라 이동하거나 X선 빔 방향으로 기관 위 좌우로 이동합니다.
또한 호흡과 심박수가 혼합되지 않은 상태에서 기도 내 입자의 가시성 및 거동을 확인하고자 했습니다.따라서 영상화 기간이 끝날 때 펜토바르비탈 과다 복용으로 인해 동물을 인도적으로 안락사시켰습니다(Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).일부 동물은 이미징 플랫폼에 남겨두고 호흡과 심장 박동이 멈춘 후 이미징 프로세스를 반복하여 기도 표면에 MP가 보이지 않는 경우 추가 용량의 MP를 추가했습니다.
결과 이미지는 플랫 및 다크 필드에 대해 보정된 다음 MATLAB(R2020a, The Mathworks)으로 작성된 사용자 정의 스크립트를 사용하여 영화(초당 20프레임, 호흡수에 따라 15–25 × 정상 속도)로 조립되었습니다.
LV 유전자 벡터 전달에 대한 모든 연구는 애들레이드 대학 실험 동물 연구 센터에서 수행되었으며 SPring-8 실험 결과를 사용하여 자기장이 있는 상태에서 LV-MP 전달이 생체 내에서 유전자 전달을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 했습니다. .MF와 자기장의 영향을 평가하기 위해 두 그룹의 동물을 치료했습니다. 한 그룹에는 자석이 배치된 LV MF가 주입되었고 다른 그룹에는 자석이 없는 LV MF가 주입된 대조군이 주입되었습니다.
LV 유전자 벡터는 이전에 설명한 방법 25, 26을 사용하여 생성되었습니다.LacZ 벡터는 MPSV 구성 프로모터(LV-LacZ)에 의해 구동되는 핵 국소 베타-갈락토시다제 유전자를 발현하며, 이는 폐 조직의 전면과 섹션에서 볼 수 있는 변환된 세포에서 파란색 반응 생성물을 생성합니다.역가를 TU/ml 단위로 계산하기 위해 혈구계산기를 사용하여 LacZ-양성 세포의 수를 수동으로 계수하여 세포 배양에서 적정을 수행했습니다.운반체는 -80°C에서 냉동 보관하고 사용하기 전에 해동하고 1:1로 혼합하여 CombiMag에 결합하고 전달하기 전에 최소 30분 동안 얼음에서 배양합니다.
정상 Sprague Dawley 쥐(n = 3/그룹, 생후 1개월에 0.4mg/kg 메데토미딘(Domitor, Ilium, Australia) 및 60mg/kg 케타민(Ilium, Australia)의 혼합물로 ~2-3 마취된 ip) ip ) 16 Ga 정맥 캐뉼라를 사용한 주사 및 비수술적 구강 캐뉼라.기관 기도 조직이 LV 변환을 받도록 하기 위해, 기관 기도 표면을 와이어 바스켓(N-Circle, 팁 NTSE-022115 없는 니티놀 석재 추출기) -UDH로 축 방향으로 문지르는 이전에 설명한 기계적 섭동 프로토콜을 사용하여 조건화했습니다. Cook Medical, USA) 30p28.그 후, biosafety cabinet에서 섭동 약 10분 후, LV-MP의 기관 투여가 수행되었다.
이 실험에 사용된 자기장은 생체 내 x-선 연구와 유사하게 구성되었으며, 동일한 자석이 증류 스텐트 클램프로 기관 위에 고정되었습니다(그림 4).LV-MP의 50μl 부피(2 x 25μl 분취량)를 이전에 설명한 바와 같이 젤 팁 피펫을 사용하여 기관(n = 3마리 동물)으로 전달했습니다.대조군(n=3마리 동물)은 자석을 사용하지 않고 동일한 LV-MP를 받았다.주입 완료 후 기관내관에서 캐뉼라를 제거하고 동물을 발관합니다.자석은 제거되기 전에 10분 동안 제자리에 남아 있습니다.쥐에게 멜록시캄(1ml/kg)(호주 일리움)을 피하 투여한 후 1mg/kg 아티파마졸 염산염(안티세단, 호주 조에티스)을 복강내 주사하여 마취를 철회했습니다.래트를 따뜻하게 유지하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰하였다.
생물학적 안전 캐비닛의 LV-MP 전달 장치.ET 튜브의 밝은 회색 Luer-lock 슬리브가 입 밖으로 돌출되어 있는 것을 볼 수 있으며, 그림에 표시된 젤 피펫 팁이 ET 튜브를 통해 기관 내 원하는 깊이까지 삽입됩니다.
LV-MP 투여 절차 1주일 후, 동물을 100% CO2 흡입으로 인도적으로 희생시켰고 LacZ 발현을 표준 X-gal 처리를 사용하여 평가했습니다.기관내관 배치로 인한 기계적 손상 또는 체액 저류가 분석에 포함되지 않도록 하기 위해 가장 꼬리 연골 고리 3개를 제거했습니다.각각의 기관을 길이 방향으로 절단하여 분석을 위한 2개의 절반을 얻었고 관강 표면을 시각화하기 위해 Minutien 바늘(Fine Science Tools)을 사용하여 실리콘 고무(Sylgard, Dow Inc)가 들어 있는 컵에 넣었습니다.변환된 세포의 분포와 특성은 DigiLite 카메라와 TCapture 소프트웨어(Tucsen Photonics, China)가 장착된 Nikon 현미경(SMZ1500)을 사용한 정면 사진으로 확인되었습니다.이미지는 20x 배율(기관의 전체 너비에 대한 최대 설정 포함)에서 획득되었으며, 기관의 전체 길이가 단계별로 표시되어 이미지가 "스티칭"될 수 있도록 각 이미지 사이에 충분한 중첩을 제공합니다.평면 모션 알고리즘을 사용하는 Composite Image Editor 버전 2.0.3(Microsoft Research)을 사용하여 각 기관의 이미지를 단일 합성 이미지로 결합했습니다. 각 동물의 기관 합성 이미지 내의 LacZ 발현 영역은 이전에 설명한28 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 및 Value < 0.7의 설정을 사용하여 정량화되었습니다. 각 동물의 기관 합성 이미지 내 LacZ 발현 영역은 이전에 설명한 대로 자동 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 및 Value < 0.7의 설정을 사용하여 정량화되었습니다. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. 각 동물의 복합 기관 이미지에서 LacZ 발현 영역은 0.35의 설정을 사용하여 이전에 설명한28 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화되었습니다.0.15 및 값<0.7.如前所述，用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用的0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 表达 量化 ， 倫用 使用 使用 0.35 <色调 只 。 。 0.58 。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . 0.35 < 색조 < 0.58, 채도 > 0.15 및 값 < 0.7의 설정을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 각 동물의 기관의 합성 이미지 상의 LacZ 발현 영역을 정량화하였다.GIMP v2.10.24에서 조직 윤곽을 추적함으로써 각 합성 이미지에 대한 마스크를 수동으로 생성하여 조직 영역을 식별하고 기관 조직 외부의 잘못된 감지를 방지했습니다.각 동물의 모든 합성 이미지에서 염색된 영역을 합산하여 해당 동물의 총 염색된 영역을 제공했습니다.그런 다음 페인팅된 영역을 마스크의 전체 영역으로 나누어 정규화된 영역을 얻었습니다.
각 기관은 파라핀에 묻혀 5μm 두께로 절단되었습니다.섹션은 5분 동안 뉴트럴 패스트 레드로 대조 염색되었고 이미지는 Nikon Eclipse E400 현미경, DS-Fi3 카메라 및 NIS 요소 캡처 소프트웨어(버전 5.20.00)를 사용하여 획득되었습니다.
모든 통계 분석은 GraphPad Prism v9(GraphPad Software, Inc.)에서 수행되었습니다.통계적 유의성은 p ≤ 0.05로 설정되었습니다.Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정상성을 테스트하고 unpaired t-test를 사용하여 LacZ 염색의 차이를 평가했습니다.
표 1에 설명된 6개의 MP는 PCXI에서 검사했으며 가시성은 표 2에 설명되어 있습니다. 2개의 폴리스티렌 MP(MP1 및 MP2; 각각 18μm 및 0.25μm)는 PCXI에서 볼 수 없었지만 나머지 샘플은 식별할 수 있었습니다. (예는 그림 5에 나와 있습니다).MP3 및 MP4는 약하게 보입니다(각각 10-15% Fe3O4, 0.25 µm 및 0.9 µm).MP5(98% Fe3O4; 0.25µm)에는 테스트한 가장 작은 입자가 일부 포함되어 있었지만 가장 두드러졌습니다.CombiMag MP6 제품은 구별하기 어렵습니다.모든 경우에 자석을 모세관과 평행하게 앞뒤로 움직여 MF를 감지하는 능력이 크게 향상되었습니다.자석이 모세관에서 멀어짐에 따라 입자는 긴 사슬로 당겨졌지만 자석이 접근하고 자기장의 세기가 증가함에 따라 입자가 모세관의 상부 표면으로 이동함에 따라 입자 사슬이 짧아졌습니다(보충 비디오 S1 참조). : MP4), 표면에서 입자 밀도를 높입니다.반대로 자석이 모세관에서 제거되면 전계 강도가 감소하고 MP가 모세관의 상부 표면에서 연장되는 긴 사슬로 재배열됩니다(보충 비디오 S2: MP4 참조).자석의 움직임이 멈춘 후에도 입자는 평형 위치에 도달한 후 일정 시간 동안 계속 움직입니다.MP가 모세관의 상부 표면을 향하거나 멀어짐에 따라 자성 입자는 액체를 통해 파편을 끌어들이는 경향이 있습니다.
PCXI에서 MP의 가시성은 샘플 간에 상당히 다릅니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6.여기에 표시된 모든 이미지는 모세관 바로 위 약 10mm에 위치한 자석으로 촬영되었습니다.명백한 큰 원은 모세관에 갇힌 기포이며 위상차 이미지의 흑백 가장자리 특징을 명확하게 보여줍니다.빨간색 상자는 대비를 향상시키는 배율을 나타냅니다.모든 그림에서 자기 회로의 직경은 축척이 아니며 표시된 것보다 약 100배 큽니다.
자석이 모세관 상단을 따라 왼쪽과 오른쪽으로 이동함에 따라 MP 스트링의 각도가 자석과 정렬되도록 변경되어(그림 6 참조) 자기장 라인을 나타냅니다.MP3-5의 경우 코드가 임계 각도에 도달한 후 입자가 모세관의 상부 표면을 따라 끌립니다.이로 인해 자기장이 가장 강한 곳 근처에서 MP가 더 큰 그룹으로 클러스터링되는 경우가 많습니다(보충 비디오 S3: MP5 참조).이것은 또한 MP가 액체-공기 계면에서 응집되고 집중되게 하는 모세관의 끝 가까이에서 이미징할 때 특히 분명합니다.MP3-5의 입자보다 구별하기 더 어려웠던 MP6의 입자는 자석이 모세관을 따라 움직일 때 끌리지 않았지만 MP 스트링이 분리되어 입자가 시야에 남게 되었습니다(보충 비디오 S4: MP6 참조).경우에 따라 이미징 사이트에서 자석을 먼 거리로 이동하여 적용된 자기장이 감소하면 나머지 MP는 중력에 의해 천천히 튜브 바닥 표면으로 내려와 끈에 남아 있습니다(보충 비디오 S5: MP3 참조). .
자석이 모세관 바로 위에서 이동함에 따라 MP 스트링의 각도가 변경됩니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6.빨간색 상자는 대비를 향상시키는 배율을 나타냅니다.추가 동영상은 이러한 정적 이미지에서 시각화할 수 없는 중요한 입자 구조 및 동적 정보를 보여주기 때문에 정보 제공용입니다.
우리의 테스트는 기관을 따라 자석을 앞뒤로 천천히 움직이는 것이 생체 내 복잡한 움직임의 맥락에서 MF의 시각화를 용이하게 한다는 것을 보여주었습니다.폴리스티렌 비드(MP1 및 MP2)가 모세관에서 보이지 않았기 때문에 생체 내 테스트는 수행되지 않았습니다.나머지 4개의 MF 각각은 수직에 대해 약 30°의 각도로 기관 위에 위치한 자석의 장축을 사용하여 생체 내에서 테스트되었습니다(그림 2b 및 3a 참조). 이는 더 긴 MF 체인을 생성하고 더 효과적이었기 때문입니다. 자석보다.구성이 종료되었습니다.MP3, MP4 및 MP6는 살아있는 동물의 기관에서 발견되지 않았습니다.동물을 인도적으로 죽인 후 쥐의 호흡기를 시각화하면 주사기 펌프를 사용하여 추가 볼륨을 추가해도 입자가 보이지 않았습니다.MP5는 산화철 함량이 가장 높았고 눈에 보이는 유일한 입자였으므로 생체 내에서 MP 거동을 평가하고 특성화하는 데 사용되었습니다.
MF 삽입 중에 기관 위에 자석을 배치하면 모두는 아니지만 많은 MF가 시야에 집중됩니다.입자의 기관 유입은 인도적으로 안락사시킨 동물에서 가장 잘 관찰됩니다.그림 7 및 보충 비디오 S6: MP5는 복부 기관 표면에 있는 입자의 빠른 자기 캡처 및 정렬을 보여주며 MP가 기관의 원하는 영역을 대상으로 할 수 있음을 나타냅니다.MF 전달 후 기관을 따라 더 먼 곳에서 검색할 때 일부 MF는 기관분기부에 더 가깝게 발견되었는데, 이는 유체 투여 중 최대 자기장 강도 영역을 통해 전달되었기 때문에 모든 MF를 수집하고 고정하기에는 자기장 강도가 불충분함을 나타냅니다.프로세스.그러나 출생 후 MP 농도는 이미지 영역 주변에서 더 높았으며, 이는 적용된 자기장 강도가 가장 높은 기도 영역에 많은 MP가 남아 있음을 시사합니다.
이미징 영역 바로 위에 자석이 있는 최근 안락사된 쥐의 기관으로 MP5를 전달하기 전과 후의 (a) 이미지.묘사된 영역은 두 개의 연골 고리 사이에 있습니다.MP가 전달되기 전에 기도에 약간의 액체가 있습니다.빨간색 상자는 대비를 향상시키는 배율을 나타냅니다.이 이미지는 S6: MP5 Supplementary Video에 포함된 비디오에서 가져온 것입니다.
생체 내에서 기관을 따라 자석을 움직이면 모세혈관에서 관찰된 것과 유사하게 기도 표면의 MP 체인 각도가 변경되었습니다(그림 8 및 보충 비디오 S7: MP5 참조).그러나 우리 연구에서 MP는 모세혈관이 할 수 있는 것처럼 살아 있는 기도의 표면을 따라 끌 수 없었습니다.경우에 따라 자석이 좌우로 이동함에 따라 MP 체인이 길어집니다.흥미롭게도 우리는 자석이 기관을 따라 종방향으로 움직일 때 입자 사슬이 유체 표면층의 깊이를 변화시키고 자석이 바로 머리 위로 움직이고 입자 사슬이 수직 위치로 회전할 때 팽창한다는 것을 발견했습니다. 보충 비디오 S7).: MP5 0:09, 오른쪽 하단).특징적인 움직임 패턴은 자석이 기관의 상단을 가로질러 측면으로 이동했을 때 변경되었습니다(즉, 기관의 길이를 따라가 아니라 동물의 왼쪽 또는 오른쪽으로).입자는 움직이는 동안 여전히 명확하게 볼 수 있었지만 자석이 기관에서 제거되었을 때 입자 문자열의 끝이 보이게 되었습니다(보충 비디오 S8: MP5, 0:08부터 시작).이것은 유리 모세관에 인가된 자기장의 작용 하에서 관찰된 자기장의 거동과 일치합니다.
라이브 마취 쥐의 기관에서 MP5를 보여주는 샘플 이미지.(a) 자석을 사용하여 기관의 위와 왼쪽에서 이미지를 획득한 다음 (b) 자석을 오른쪽으로 이동한 후 이미지를 획득합니다.빨간색 상자는 대비를 향상시키는 배율을 나타냅니다.이 이미지는 S7의 보충 비디오: MP5에 포함된 비디오에서 가져온 것입니다.
두 극이 기관 위와 아래에서 남북 방향으로 조정되었을 때(즉, 유인, 그림 3b), MP 코드는 더 길게 나타나고 기관의 등쪽 표면보다는 기관의 측면 벽에 위치했습니다. 기관(부록 참조).비디오 S9:MP5).그러나 일반적으로 단일 자석 장치에서 발생하는 이중 자석 장치를 사용하여 수액을 투여한 후 한 부위(즉, 기관의 배면)에서 고농도의 입자가 검출되지 않았습니다.그런 다음 하나의 자석이 반대 극을 밀어내도록 구성되었을 때(그림 3c), 시야에서 볼 수 있는 입자의 수는 배달 후 증가하지 않았습니다.두 개의 자석 구성을 설정하는 것은 각각 자석을 끌어당기거나 밀어내는 높은 자기장 강도로 인해 어렵습니다.그런 다음 설정을 기도와 평행하지만 90도 각도로 기도를 통과하는 단일 자석으로 변경하여 힘의 선이 기관 벽을 직각으로 교차하도록 했습니다(그림 3d). 측면 벽.관찰하다.그러나 이 구성에서는 식별 가능한 MF 축적 이동 또는 자석 이동이 없었습니다.이러한 모든 결과를 바탕으로 유전자 운반체의 생체 내 연구를 위해 단일 자석과 30도 방향의 구성이 선택되었습니다(그림 3a).
동물이 인도적으로 희생된 직후에 여러 번 이미지를 촬영했을 때 간섭 조직 움직임이 없다는 것은 자석의 병진 운동에 따라 '흔들리는' 명확한 연골 간 필드에서 더 미세하고 짧은 입자 라인을 식별할 수 있음을 의미했습니다.MP6 입자의 존재와 움직임을 명확하게 볼 수 있습니다.
LV-LacZ의 역가는 1.8 x 108 IU/mL이었고 CombiMag MP(MP6)와 1:1로 혼합한 후 9 x 107 IU/ml의 LV 비히클(즉, 4.5 x 106 TU/쥐).).).이 연구에서는 분만 중에 자석을 움직이는 대신 자석을 한 위치에 고정하여 LV 변환이 (a) 자기장이 없는 벡터 전달에 비해 개선될 수 있는지, (b) 기도가 집중하다.상기도의 자기 표적 영역에서 형질도입되는 세포.
자석의 존재와 LV 벡터와 조합된 CombiMag의 사용은 우리의 표준 LV 벡터 전달 프로토콜처럼 동물 건강에 악영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.기계적인 섭동을 받은 기관 부위의 정면 이미지(보조 그림 1)는 LV-MP 처리 그룹이 자석의 존재 하에서 상당히 높은 수준의 변환을 가짐을 보여주었습니다(그림 9a).대조군에는 소량의 청색 LacZ 염색만 존재했습니다(그림 9b).X-Gal로 염색된 정규화된 영역의 정량화는 자기장이 있는 상태에서 LV-MP를 투여하면 약 6배 향상됨을 보여주었습니다(그림 9c).
자기장이 있는 경우와 (b) 자석이 없는 경우 LV-MP(a)로 기관 변환을 보여주는 합성 이미지의 예.(c) 자석을 사용하여 기관에서 LacZ 변환의 정규화 영역에서 통계적으로 유의미한 개선(*p = 0.029, t-테스트, 그룹당 n = 3, 평균 ± 평균의 표준 오차).
중립적 인 빠른 적색 염색 섹션 (보충 그림 2에 표시된 예)은 LacZ 염색 세포가 이전에보고 된 것과 동일한 샘플 및 동일한 위치에 있음을 나타냅니다.
기도 유전자 치료의 핵심 과제는 관심 영역에서 운반체 입자의 정확한 위치 파악과 기류 및 활성 점액 제거가 있는 이동성 폐에서 높은 수준의 전달 효율을 달성하는 것입니다.낭포성 섬유증의 호흡기 질환을 치료하기 위한 좌심실 담체의 경우, 전도성 기도에서 담체 입자의 체류 시간을 증가시키는 것은 지금까지 달성할 수 없는 목표였습니다.Castellani 등이 지적한 바와 같이, 형질도입을 강화하기 위해 자기장을 사용하는 것은 단순성, 경제성, 국소 전달, 증가된 효율성 및 짧은 잠복기 시간을 결합할 수 있기 때문에 전기천공법과 같은 다른 유전자 전달 방법보다 이점이 있습니다.차량10의 저용량일 가능성이 있습니다.그러나 외부 자기력의 영향을 받는 기도에서 자성 입자의 생체 내 침착 및 거동은 설명된 적이 없으며 실제로 온전한 살아있는 기도에서 유전자 발현 수준을 증가시키는 이 방법의 능력은 생체 내에서 입증되지 않았습니다.
PCXI 싱크로트론에 대한 체외 실험에서는 MP 폴리스티렌을 제외하고 테스트한 모든 입자가 우리가 사용한 이미징 설정에서 볼 수 있음을 보여주었습니다.자기장이 있는 경우 자기장은 끈을 형성하며 그 길이는 입자 유형 및 자기장의 강도(즉, 자석의 근접성 및 이동)와 관련이 있습니다.그림 10에서 볼 수 있듯이 각 개별 입자가 자화되고 자체 로컬 자기장을 유도함에 따라 우리가 관찰하는 끈이 형성됩니다.이러한 별도의 필드는 다른 입자의 로컬 인력 및 반발력의 로컬 힘으로 인해 다른 유사한 입자를 수집하고 그룹 스트링 모션과 연결하게 합니다.
(a, b) 유체로 채워진 모세관 내부에 형성되는 입자 사슬과 (c, d) 공기로 채워진 기관을 보여주는 다이어그램.모세혈관과 기관은 크기에 맞게 그려지지 않습니다.패널 (a)에는 체인으로 배열된 Fe3O4 입자를 포함하는 MF에 대한 설명도 포함되어 있습니다.
자석이 모세관 위로 움직일 때, 입자 스트링의 각도는 Fe3O4를 포함하는 MP3-5에 대한 임계 임계값에 도달한 후 입자 스트링이 더 이상 원래 위치에 머물지 않고 표면을 따라 새로운 위치로 이동했습니다.자석.이 효과는 유리 모세관의 표면이 이러한 움직임이 발생할 수 있을 만큼 충분히 매끄럽기 때문에 발생합니다.흥미롭게도 MP6(CombiMag)는 이러한 방식으로 작동하지 않았습니다. 아마도 입자가 더 작거나 다른 코팅 또는 표면 전하를 가졌거나 전용 캐리어 유체가 이동 능력에 영향을 미쳤기 때문일 것입니다.CombiMag 입자 이미지의 대비도 약하여 액체와 입자가 동일한 밀도를 가질 수 있으므로 서로를 향해 쉽게 이동할 수 없음을 나타냅니다.자석이 너무 빨리 움직이면 입자가 달라붙을 수 있는데, 이는 자기장 강도가 유체 내 입자 사이의 마찰을 항상 극복할 수 없음을 나타냅니다. 놀라다.중요한.이러한 결과는 또한 자석이 대상 영역을 통해 흐르는 많은 미세 입자를 포착할 수 있지만 기관 표면을 따라 CombiMag 입자를 이동시키는 데 자석이 의존할 가능성이 낮다는 것을 나타냅니다.따라서 우리는 생체 내 좌심실 MF 연구가 정적 자기장을 사용하여 기도 나무의 특정 영역을 물리적으로 표적으로 삼아야 한다고 결론지었습니다.
입자가 체내로 전달되면 신체의 복잡한 움직이는 조직의 맥락에서 식별하기 어렵지만 기관에서 자석을 수평으로 이동하여 MP 스트링을 "흔들림"으로써 감지 기능이 향상되었습니다.실시간 이미징이 가능하지만 동물을 인도적으로 죽인 후 입자 움직임을 식별하는 것이 더 쉽습니다.MP 농도는 일반적으로 자석이 이미징 영역 위에 위치했을 때 이 위치에서 가장 높았지만 일부 입자는 일반적으로 기관 아래에서 더 많이 발견되었습니다.체외 연구와 달리 입자는 자석의 움직임에 의해 기관 아래로 끌릴 수 없습니다.이 발견은 기관의 표면을 덮고 있는 점액이 일반적으로 흡입된 입자를 처리하여 점액에 가두어 점액 섬모 제거 메커니즘을 통해 제거하는 방법과 일치합니다.
우리는 인력을 위해 기관 위와 아래에 자석을 사용하면(그림 3b) 자기장이 한 지점에 집중되어 잠재적으로 입자가 더 균일하게 분포되는 것이 아니라 더 균일한 자기장이 발생할 수 있다는 가설을 세웠습니다..그러나 예비 연구에서는 이 가설을 뒷받침할 명확한 증거를 찾지 못했습니다.마찬가지로 한 쌍의 자석을 반발하도록 설정해도(그림 3c) 이미지 영역에 더 많은 입자가 침전되지 않았습니다.이 두 가지 결과는 이중 자석 설정이 MP 포인팅의 로컬 제어를 크게 개선하지 않으며 결과적으로 강력한 자기력을 조정하기 어려워 이 접근 방식의 실용성이 떨어짐을 보여줍니다.유사하게, 자석을 기관 위 및 가로질러 배향시키는 것(그림 3d)도 이미지 영역에 남아 있는 입자의 수를 증가시키지 않았습니다.이러한 대체 구성 중 일부는 증착 영역에서 자기장 강도를 감소시키므로 성공하지 못할 수 있습니다.따라서 30도에서의 단일 자석 구성(그림 3a)은 생체 내 테스트 방법 중 가장 간단하고 가장 효율적인 것으로 간주됩니다.
LV-MP 연구는 LV 벡터가 CombiMag와 결합되어 자기장의 존재 하에서 물리적 방해를 받은 후 전달되었을 때 전달 수준이 대조군에 비해 기관에서 크게 증가했음을 보여주었습니다.싱크로트론 이미징 연구와 LacZ 결과를 기반으로 자기장은 기관에 좌심실을 유지하고 즉시 폐 깊숙이 침투하는 벡터 입자의 수를 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다.이러한 표적 개선은 전달된 역가, 비표적 형질도입, 염증 및 면역 부작용, 유전자 전달 비용을 줄이면서 효율성을 높일 수 있습니다.제조업체에 따르면 CombiMag는 다른 바이러스 벡터(예: AAV) 및 핵산을 포함한 다른 유전자 전달 방법과 함께 사용할 수 있습니다.