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Toxoplasma gondii는 감염된 숙주의 미세환경을 조절하는 세포내 원생동물 기생충이며 뇌종양 성장의 발병률과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다.이 연구에서 우리는 Toxoplasma 감염의 exosomal miRNA-21이 뇌종양 성장을 촉진한다는 가설을 세웠습니다.톡소플라즈마에 감염된 BV2 미세아교세포의 엑소좀을 특성화하고 U87 신경아교종 세포의 내재화를 확인했습니다.Toxoplasma gondii 및 종양 분류와 관련된 microRNA 및 microRNA-21A-5p 어레이를 사용하여 Exosomal microRNA 발현 프로필을 분석했습니다.우리는 또한 엑소좀의 miR-21 수준과 인간 U87 신경교종 세포 증식에 ​​대한 엑소좀의 효과를 변경하여 U87 신경교종 세포에서 종양 관련 유전자의 mRNA 수준을 조사했습니다.Toxoplasma gondii에 감염된 U87 신경아교종 세포의 엑소좀에서 microRNA-21의 발현이 증가하고 항종양 유전자(FoxO1, PTEN 및 PDCD4)의 활성이 감소합니다.Toxoplasma에 감염된 BV2 유래 엑소좀은 U87 신경아교종 세포의 증식을 유도합니다.엑소좀은 마우스 종양 모델에서 U87 세포의 성장을 유도합니다.우리는 Toxoplasma에 감염된 BV2 미세아교세포에서 증가된 exosomal miR-21이 항종양 유전자를 하향 조절함으로써 U87 신경아교종 세포에서 세포 성장 촉진제로서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안합니다.
2018년에는 전 세계적으로 1,810만 건 이상의 진행성 암 사례가 진단되었으며, 매년 약 297,000건의 중추신경계 종양이 진단되었습니다(전체 종양의 1.6%)1.이전 연구에서는 인간의 뇌종양 발생 위험 요인에 다양한 화학 제품, 가족력, 두부 치료 및 진단 장비의 이온화 방사선이 포함된다는 사실이 밝혀졌습니다.그러나 이러한 악성 종양의 정확한 원인은 알려져 있지 않습니다.전 세계 모든 암의 약 20%는 바이러스, 박테리아 및 기생충을 포함한 감염원에 의해 발생합니다3,4.감염성 병원체는 DNA 복구 및 세포 주기와 같은 숙주 세포의 유전적 메커니즘을 방해하고 만성 염증 및 면역 체계 손상을 유발할 수 있습니다5.
인간 암과 관련된 감염원은 인간 유두종 바이러스 및 B형 및 C형 간염 바이러스를 포함하는 가장 흔한 바이러스성 병원체입니다.기생충은 또한 인간 암 발병에 잠재적인 역할을 할 수 있습니다.여러 기생충 종, 즉 Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis 및 Hymenolepis nana는 다양한 유형의 인간 암과 관련이 있습니다 6,7,8.
Toxoplasma gondii는 감염된 숙주 세포의 미세 환경을 조절하는 세포 내 원생 동물입니다.이 기생충은 세계 인구의 약 30%를 감염시켜 전체 인구를 위험에 빠뜨리는 것으로 추정됩니다9,10.톡소플라스마 곤디는 중추신경계(CNS)를 포함한 중요한 장기를 감염시킬 수 있으며, 특히 면역 저하 환자에서 치명적인 수막염 및 뇌염과 같은 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다9.그러나 Toxoplasma gondii는 면역 능력이 있는 개인의 세포 성장과 면역 반응을 조절하여 감염된 숙주의 환경을 변경하여 무증상 만성 감염을 유지하게 할 수도 있습니다9,11.흥미롭게도, T. gondii 유병률과 뇌종양 발병 사이의 상관관계를 고려할 때, 일부 보고서는 만성 T. gondii 감염으로 인한 생체 내 숙주 환경 변화가 종양 미세 환경과 유사하다고 제안합니다.
엑소좀은 이웃 세포로부터 단백질과 핵산을 포함한 생물학적 내용물을 전달하는 세포간 커뮤니케이터로 알려져 있습니다16,17.엑소좀은 종양 미세 환경에서 항-아폽토시스, 혈관신생 및 전이와 같은 종양 관련 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.특히 miRNA(miRNA)는 약 22개 뉴클레오티드 길이의 작은 비암호화 RNA로 miRISC(miRNA-induced silencing complex)를 통해 인간 mRNA의 30% 이상을 조절하는 중요한 전사 후 유전자 조절자입니다.Toxoplasma gondii는 감염된 숙주에서 miRNA 발현을 제어하여 생물학적 과정을 방해할 수 있습니다.숙주 miRNA는 기생충의 생존 전략을 달성하기 위해 숙주의 생물학적 과정을 조절하는 중요한 신호를 포함합니다.따라서 T. gondii 감염 시 숙주 miRNA 프로필의 변화를 연구하면 숙주와 T. gondii 간의 상호 작용을 보다 명확하게 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.실제로, Thirugnanam et al.15는 T. gondii가 종양 성장과 관련된 특정 숙주 miRNA에 대한 발현을 변경하여 뇌 발암을 촉진한다고 제안했으며 T. gondii가 실험 동물에서 신경아교종을 유발할 수 있음을 발견했습니다.
이 연구는 Toxoplasma BV2에 감염된 숙주 미세아교세포에서 엑소좀 miR-21의 변경에 초점을 맞추고 있습니다.우리는 과발현된 miR-21의 표적인 FoxO1/p27의 핵 내 보유로 인해 U87 신경아교종 세포의 성장에서 변형된 엑소좀 miR-21의 가능한 역할을 관찰했습니다.
BV2에서 파생된 엑소좀은 차등 원심분리를 사용하여 얻었고 세포 구성 요소 또는 다른 소포로의 오염을 방지하기 위해 다양한 방법으로 검증되었습니다.SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)은 BV2 세포와 엑소좀에서 추출한 단백질 사이에 뚜렷한 패턴을 보여주었고(그림 1A), 샘플에서 Alix의 존재를 평가했으며, 이는 .알릭스 라벨링은 엑소좀 단백질에서 발견되었지만 BV2 세포 용해물 단백질에서는 발견되지 않았습니다(그림 1B).또한, BV2 유래 엑소좀으로부터 정제된 RNA를 바이오애널라이저를 이용하여 분석하였다.18S 및 28S 리보솜 소단위는 엑소좀 RNA 이동 패턴에서 거의 관찰되지 않았으며 이는 신뢰할 수 있는 순도를 나타냅니다(그림 1C).마지막으로, 투과전자현미경은 관찰된 엑소좀의 크기가 약 60-150 nm이고 엑소좀 형태의 전형적인 컵과 같은 구조를 가지고 있음을 보여주었습니다(그림 1D).
BV2 세포에서 유래한 엑소좀의 특성화.(A) 안전 데이터 시트 페이지.단백질은 BV2 세포 또는 BV2에서 파생된 엑소좀에서 분리되었습니다.단백질 패턴은 세포와 엑소좀 간에 다릅니다.(B) 엑소좀 마커(Alix)의 웨스턴 블롯 분석.(C) 바이오분석기를 사용하여 BV2 세포 및 BV2 유래 엑소좀으로부터 정제된 RNA의 평가.따라서 BV2 세포의 18S 및 28S 리보솜 서브유닛은 엑소좀 RNA에서 거의 발견되지 않았다.(D) 투과 전자 현미경은 BV2 세포로부터 분리된 엑소좀이 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색되었음을 보여주었다.엑소좀은 크기가 약 60-150 nm이고 컵 모양입니다(Song and Jung, 미공개 데이터).
공초점 현미경을 사용하여 BV2 유래 엑소좀의 U87 인간 신경아교종 세포로의 세포 내재화를 관찰했습니다.PKH26 표지된 엑소좀은 U87 세포의 세포질에 위치합니다.핵은 DAPI로 염색되었으며(그림 2A), 이는 BV2 유래 엑소좀이 숙주 세포에 의해 내재화될 수 있고 수용 세포의 환경에 영향을 미칠 수 있음을 나타냅니다.
BV2 유래 엑소좀의 U87 신경아교종 세포로의 내재화 및 Toxoplasma RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀은 U87 신경교종 세포의 증식을 유도했습니다.(A) 공초점 현미경으로 측정한 U87 세포에 의해 삼켜진 엑소좀.U87 신경아교종 세포를 PKH26(빨간색)으로 표지된 엑소좀과 함께 또는 대조군 없이 24시간 동안 배양했습니다.핵을 DAPI(파란색)로 염색한 다음 공초점 현미경(축척 막대: 10μm, x 3000)으로 관찰했습니다.(B) U87 신경아교종 세포 증식은 세포 증식 검정에 의해 결정되었다.U87 신경아교종 세포를 지정된 시간 동안 엑소좀으로 처리하였다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *Student's t-test에 의한 P < 0.05. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05는 Student's t-test를 사용하여 구했습니다.
BV2 유래 엑소좀의 U87 신경아교종 세포로의 내재화를 확인한 후, 인간 신경교종 세포의 발달에서 BV2 유래 톡소플라즈마 유래 엑소좀의 역할을 조사하기 위해 세포 증식 분석을 수행했습니다.T. gondii에 감염된 BV2 세포의 엑소좀으로 U87 세포를 처리한 결과 T. gondii에 감염된 BV2 유래 엑소좀이 대조군에 비해 U87 세포의 증식이 유의하게 더 높았습니다(그림 2B).
또한, U118 세포의 성장은 U87과 동일한 결과를 나타냈는데, 이는 톡소플라스마 자극 엑소좀이 최고 수준의 증식을 야기했기 때문입니다(데이터는 표시되지 않음).이러한 데이터를 바탕으로 우리는 BV2 유래 Toxoplasma에 감염된 엑소좀이 신경아교종 세포 증식에 ​​중요한 역할을 한다는 것을 나타낼 수 있습니다.
Toxoplasma에 감염된 BV2 유래 엑소좀이 종양 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해 U87 신경아교종 세포를 이종이식 모델용 누드 마우스에 주입하고 BV2 유래 엑소좀 또는 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀을 주입했습니다.1주일 후 종양이 뚜렷해진 후 종양의 크기에 따라 각각 5마리씩 실험군을 나누어 동일한 시작점을 정하고 22일 동안 종양의 크기를 측정하였다.
U87 이종이식 모델이 있는 마우스에서 22일째에 BV2 유래 RH 감염 엑소좀 그룹에서 훨씬 더 큰 종양 크기와 무게가 관찰되었습니다(그림 3A,B).반면, 엑소좀 처리 후 BV2 유래 엑소좀군과 대조군의 종양 크기는 유의한 차이가 없었다.또한 신경아교종 세포와 엑소좀을 주사한 마우스는 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀 그룹에서 시각적으로 가장 큰 종양 부피를 나타냈습니다(그림 3C).이러한 결과는 BV2 유래 톡소플라즈마 감염 엑소좀이 마우스 종양 모델에서 신경아교종 성장을 유도함을 입증합니다.
U87 이종이식 마우스 모델에서 BV2 유래 엑소좀의 발암(AC).종양 크기(A)와 무게(B)는 BV2에서 파생된 RH에 감염된 엑소좀으로 처리된 BALB/c 누드 마우스에서 유의하게 증가했습니다.BALB/c 누드 마우스(C)에 Matrigel 혼합물에 현탁된 1 x 107 U87 세포를 피하 주사했습니다.주입 6일 후 BV2 유래 엑소좀 100μg을 마우스에 처리했습니다.종양 크기와 무게는 지정된 날과 희생 후 각각 측정되었습니다. *P < 0.05. *P < 0.05. * ρ < 0,05. *P < 0.05. *P < 0.05。 *P < 0.05。 * ρ < 0,05. *P < 0.05.
데이터는 면역 또는 종양 발달과 관련된 37개의 miRNA(과발현된 16개 및 하향 발현된 21개)가 Toxoplasma RH 균주 감염 후 미세아교 세포에서 유의하게 변경되었음을 보여주었습니다(그림 4A).변경된 miRNA 중 miR-21의 상대적인 발현 수준은 BV2로부터 유래된 엑소좀, BV2 및 U87 세포로 처리된 엑소좀에서 실시간 RT-PCR에 의해 확인되었다.miR-21의 발현은 Toxoplasma gondii(RH 균주)에 감염된 BV2 세포의 엑소좀에서 상당한 증가를 보여주었습니다(그림 4B).BV2 및 U87 세포에서 miR-21의 상대적인 발현 수준은 변경된 엑소좀의 섭취 후 증가했습니다(그림 4B).Toxoplasma gondii (ME49 strain)에 감염된 종양 환자와 마우스의 뇌 조직에서 상대적인 miR-21 발현 수준은 각각 대조군보다 높았습니다 (그림 4C).이러한 결과는 시험관 내 및 생체 내에서 예측된 마이크로RNA와 확인된 마이크로RNA의 발현 수준 간의 차이와 관련이 있습니다.
Toxoplasma gondii (RH)에 감염된 소교 세포에서 exosomal miP-21a-5p의 발현 변화.(A) T. gondii RH 감염 후 면역 또는 종양 발달과 관련된 siRNA의 중요한 변화를 보여줍니다.(B) 상대 miR-21 발현 수준은 BV2 유래 엑소좀, BV2 처리 엑소좀 및 U87 세포에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출되었습니다.(C) 상대 miR-21 발현 수준은 종양 환자(N=3) 및 Toxoplasma gondii(ME49 균주)에 감염된 마우스(N=3)의 뇌 조직에서 발견되었습니다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05는 Student's t-test를 사용하여 얻었습니다. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05는 Student's t-test를 사용하여 구했습니다.
RH에 감염된 BV2 세포의 엑소좀은 생체 내 및 시험관 내에서 신경아교종의 성장을 유도했습니다(그림 2, 3).관련 mRNA를 검출하기 위해 우리는 BV2 또는 RH BV2에서 파생된 엑소좀으로 감염된 U87 세포에서 항종양 표적 유전자, 포크헤드 박스 O1(FoxO1), PTEN 및 프로그램된 세포 사멸 4(PDCD4)의 mRNA 수준을 검사했습니다.생물정보학 분석은 FoxO1, PTEN 및 PDCD4 유전자를 포함한 여러 종양 관련 유전자가 miR-2121,22 결합 부위를 가지고 있음을 보여주었습니다.BV2 유래 엑소좀에 비해 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀에서 항종양 표적 유전자의 mRNA 수준이 감소하였다(도 5A).FoxO1은 BV2 유래 엑소좀과 비교하여 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀에서 감소된 단백질 수준을 보였습니다(그림 5B).이러한 결과를 바탕으로 우리는 RH에 감염된 BV2에서 유래된 엑소좀이 종양 성장에서 그 역할을 유지하면서 항종양 유전자를 하향 조절함을 확인할 수 있었습니다.
톡소플라즈마 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀은 톡소플라즈마 RH에 감염된 BV2 유래 엑소좀에 의해 U87 신경아교종 세포에서 항종양 유전자의 억제를 유도합니다.(A) PBS 엑소좀과 비교하여 T. gondii RH-감염된 BV2로부터 유래된 엑소좀에서의 FoxO1, PTEN 및 PDCD4 발현의 실시간 PCR.β-액틴 mRNA를 대조군으로 사용하였다.(B) FoxO1 발현은 웨스턴 블로팅에 의해 결정되었고 농도 측정 데이터는 ImageJ 프로그램을 사용하여 통계적으로 평가되었습니다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. * P < 0.05는 Student 's t test로 얻었습니다. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0.05는 Student's t-test를 사용하여 얻었습니다. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05는 Student's t-test를 사용하여 구했습니다.
엑소좀에서 miP-21이 종양 관련 유전자 조절에 미치는 영향을 이해하기 위해 U87 세포를 Lipofectamine 2000을 사용하여 miP-21 억제제로 형질감염시켰고 형질감염 24시간 후에 세포를 수확했습니다.miR-21 억제제로 형질감염된 세포의 FoxO1 및 p27 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 BV2 유래 엑소좀으로 처리한 세포와 ​​비교했습니다(그림 6A,B).U87 세포로의 miR-21 억제제의 형질감염은 FoxO1 및 p27 발현을 상당히 하향조절하였다(도 6).
RH에 감염된 엑소좀 BV2 유래 miP-21은 U87 신경아교종 세포에서 FoxO1/p27 발현을 변경했습니다.U87 세포는 Lipofectamine 2000을 사용하여 miP-21 억제제로 형질감염되었고 세포는 형질감염 24시간 후에 수확되었습니다.miR-21 억제제로 형질감염된 세포의 FoxO1 및 p27 발현 수준을 qRT-PCR을 사용하여 BV2 유래 엑소좀으로 처리한 세포의 수준과 비교했습니다(A, B).
숙주의 면역 반응을 피하기 위해 Toxoplasma 기생충은 조직 낭종으로 변형됩니다.그들은 숙주의 일생 동안 뇌, 심장 및 골격근을 포함한 다양한 조직에 기생하고 숙주의 면역 반응을 조절합니다.또한 숙주 세포의 세포 주기와 세포 사멸을 조절하여 증식을 촉진할 수 있습니다14,24.Toxoplasma gondii는 주로 뇌 미세아교세포를 포함한 숙주 수지상 세포, 호중구 및 단핵구/대식세포 계통을 감염시킵니다.Toxoplasma gondii는 M2 표현형의 대식세포의 분화를 유도하고, 병원체 감염 후 상처 치유에 영향을 미치며, 또한 혈관과다형성 및 육아종성 섬유증과 관련이 있습니다.Toxoplasma 감염의 이러한 행동 병인은 종양 발달과 관련된 마커와 관련이 있을 수 있습니다.Toxoplasma에 의해 규제되는 적대적인 환경은 해당 전암과 유사할 수 있습니다.따라서 Toxoplasma 감염이 뇌종양의 발달에 기여해야 한다고 가정할 수 있습니다.실제로 다양한 뇌종양 환자의 혈청에서 높은 비율의 톡소플라스마 감염이 보고되었습니다.또한 Toxoplasma gondii는 또 다른 발암성 효과인자일 수 있으며 다른 전염성 발암물질이 뇌종양을 발달시키는 데 시너지 효과를 발휘합니다.이와 관련하여 P. falciparum과 Epstein-Barr 바이러스가 Burkitt 림프종의 형성에 상승적으로 기여한다는 점은 주목할 가치가 있습니다.
암 연구 분야에서 조절자로서의 엑소좀의 역할은 광범위하게 조사되었습니다.그러나 기생충과 감염된 숙주 사이의 엑소좀의 역할은 잘 알려져 있지 않습니다.지금까지 분비 단백질을 포함한 다양한 조절자들은 원생동물 기생충이 숙주 공격에 저항하고 감염을 지속시키는 생물학적 과정을 설명했습니다.최근에는 원생동물 관련 미세소포체와 그 microRNA가 숙주 세포와 상호 작용하여 생존에 유리한 환경을 조성한다는 개념이 커지고 있습니다.따라서 변형된 엑소좀 miRNA와 신경아교종 세포 증식 사이의 관계를 발견하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다.MicroRNA 변형(클러스터 유전자 miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 및 miR-17-92)은 톡소플라스마에 감염된 인간 대식세포의 STAT3 프로모터에 결합하고 조절되며 항염증을 유도합니다. - Toxoplasma gondii 감염 29에 대한 반응으로 인한 세포 사멸.톡소플라즈마 감염은 miR-17-5p 및 miR-106b-5p의 발현을 증가시키며, 이는 여러 과증식성 질환과 관련이 있습니다 30 .이러한 데이터는 Toxoplasma 감염에 의해 조절되는 숙주 miRNA가 숙주의 생물학적 행동에서 기생충 생존 및 병인에 중요한 분자임을 시사합니다.
변경된 miRNA는 신경아교종을 포함하여 악성 세포의 시작 및 진행 동안 다양한 유형의 행동에 영향을 미칠 수 있습니다: 성장 신호의 자급 자족, 성장 억제 신호에 대한 무감각, 세포 사멸 회피, 무제한 복제 가능성, 혈관 신생, 침입 및 전이, 염증.신경아교종에서 변경된 miRNA가 여러 발현 프로파일링 연구에서 확인되었습니다.
현재 연구에서 우리는 toxoplasma에 감염된 숙주 세포에서 높은 수준의 miRNA-21 발현을 확인했습니다.miR-21은 신경아교종을 포함하는 고형 종양에서 가장 빈번하게 과발현되는 마이크로RNA 중 하나로 확인되었으며 33 그 발현은 신경교종의 등급과 관련이 있습니다.축적된 증거는 miR-21이 신경아교종 성장에서 항-아폽토시스 인자로 작용하고 인간 뇌 악성종양의 조직 및 혈장에서 고도로 과발현되는 새로운 종양 유전자임을 시사합니다.흥미롭게도, 신경아교종 세포 및 조직에서의 miR-21 불활성화는 카스파제-의존성 아폽토시스로 인한 세포 증식 억제를 유발한다.miR-21 예측 표적의 생물정보학적 분석은 miR-2121 결합 부위가 있는 PDCD4(programd cell death 4), TPM1(tropomyosin), PTEN 및 forkhead box O1(FoxO1)을 포함한 세포자멸사 경로와 관련된 여러 종양 억제 유전자를 밝혀냈습니다..22.38.
FoxO1은 전사 인자(FoxO) 중 하나로서 다양한 유형의 인간 암 발생에 관여하며 p21, p27, Bim 및 FasL40과 같은 종양 억제 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다.FoxO1은 세포 성장을 억제하기 위해 p27과 같은 세포 주기 억제제에 결합하고 활성화할 수 있습니다.더욱이, FoxO1은 PI3K/Akt 신호 전달의 핵심 이펙터이며 p2742 전사의 활성화를 통해 세포 주기 진행 및 세포 분화와 같은 많은 생물학적 과정을 조절합니다.
결론적으로, 우리는 Toxoplasma에 감염된 미세아교세포에서 파생된 엑소좀 miR-21이 신경아교종 세포의 성장 조절자로서 중요한 역할을 할 수 있다고 믿습니다(그림 7).그러나 exosomal miR-21, 변경된 Toxoplasma 감염 및 신경아 교종 성장 사이의 직접적인 연관성을 찾기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.이러한 결과는 톡소플라즈마 감염과 신경교종 발생과의 관계를 연구하는 출발점이 될 것으로 기대된다.
신경아교종(뇌) 발암 메커니즘의 개략도가 본 연구에서 제안된다.작성자는 PowerPoint 2019(Microsoft, Redmond, WA)에서 그림을 그립니다.
동물 사용을 포함한 본 연구의 모든 실험 프로토콜은 서울대학교 동물관리 및 사용자위원회 표준윤리지침에 따랐으며 서울대학교 의과대학 임상심사위원회(IRB 번호 SNU- 150715).-2).모든 실험 절차는 ARRIVE 권장 사항에 따라 수행되었습니다.
BV2 마우스 미세아교세포와 U87 인간 신경아교종 세포는 각각 10% 소태아혈청, 4mM l- 글루타민, 0.2mM 페니실린 및 0.05mM 스트렙토마이신.세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다.또 다른 신경아교종 세포주인 U118을 U87 세포와의 비교에 사용했습니다.
T. gondii에 감염된 RH 및 ME49 계통에서 엑소좀을 분리하기 위해 T. gondii 타키조이트(RH 계통)를 3-4일 전에 주사한 6주령 BALB/c 마우스의 복강에서 채취했습니다.타키조이트를 PBS로 3회 세척하고 40% Percoll(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 원심분리하여 정제했습니다43.균주 ME49의 타키조이트를 얻기 위해, BALB/c 마우스에 20개의 조직 낭종을 복강내 주사하고 감염 후 6-8일째 복강을 세척하여 낭종의 타키조이트 형질전환을 수집하였다(PI).PBS에 감염된 마우스.ME49 타키조이트는 100 μg/ml 페니실린(Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco/BRL) 및 5% 태아 소 혈청(Lonza, Walkersville, MD)이 보충된 세포에서 성장했습니다. .., 미국) 37 °C 및 5% 이산화탄소에서.Vero 세포에서 배양한 후, ME49 타키조이트를 25 게이지 바늘을 통해 두 번 통과시킨 다음 5 μm 필터를 통해 파편과 세포를 제거했습니다.세척 후, 타키조이트를 PBS44에 재현탁시켰다.Toxoplasma gondii 균주 ME49의 조직 낭종은 감염된 C57BL/6 마우스(Orient Bio Animal Center, 성남, 한국)의 뇌에서 분리한 낭종을 복강내 주사하여 유지시켰다.ME49에 감염된 마우스의 뇌는 PI 3개월 후 수확하고 현미경으로 잘게 썰어 낭종을 분리했습니다.감염된 마우스는 서울대학교 의과대학에서 특수무균조건(SPF) 하에 사육되었다.
miRNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 BV2 유래 엑소좀, BV2 세포 및 조직으로부터 총 RNA를 용출 단계를 위한 배양 시간을 포함하여 제조업체의 지침에 따라 추출했습니다.RNA 농도는 NanoDrop 2000 분광광도계에서 결정되었습니다.RNA 마이크로어레이의 품질은 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies, Amstelveen, the Netherlands)를 사용하여 평가되었습니다.
10% exosome-poor FBS가 포함된 DMEM은 100,000g에서 16시간 동안 4°C에서 초원심분리하여 준비하고 0.22μm 필터(Nalgene, Rochester, NY, USA)를 통해 여과했습니다.BV2 세포, 5 × 105는 37°C 및 5% CO2에서 10% exosome-depleted FBS 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM에서 배양되었습니다.24시간 배양 후, 균주 RH 또는 ME49(MOI = 10)의 타키조이트를 세포에 첨가하고 비침습성 기생충을 1시간 이내에 제거하고 DMEM으로 다시 채웠다.BV2 세포의 엑소좀은 가장 널리 사용되는 방법인 수정된 차등 원심분리로 분리되었습니다.RNA 또는 단백질 분석을 위해 300 μl PBS에서 엑소좀 펠릿을 재현탁합니다.분리된 엑소좀의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA) 및 NanoDrop 2000 분광광도계를 사용하여 결정되었습니다.
BV2 세포로부터의 침전물 또는 BV2로부터 유래된 엑소좀을 PRO-PREP™ 단백질 추출 용액(iNtRon Biotechnology, 성남, 한국)에 용해시키고 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다.또한, 단백질을 2시간 동안 PVDF 막으로 옮겼다.웨스턴 블롯은 Alix 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 엑소좀 마커로 사용하여 검증되었습니다.HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) 및 LAS-1000 플러스 발광 이미지 분석기(Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan)를 2차 항체로 사용하였다..엑소좀의 크기와 형태를 연구하기 위해 투과전자현미경을 시행하였다.BV2 세포(6.40 μg/μl)에서 분리된 엑소좀은 탄소 코팅 메쉬에 준비되었고 1분 동안 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색되었습니다.ES1000W Erlangshen CCD 카메라(Gatan, Pleasanton, CA, USA)가 장착된 JEOL 1200-EX II(Tokyo, Japan)를 사용하여 준비된 샘플을 80 kV의 가속 전압에서 관찰하였다.
BV2 유래 엑소좀을 PKH26 Red Fluorescent Linker Kit(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 실온에서 15분 동안 염색하였다.음성 대조군으로서 PKH26-표지된 엑소좀(빨간색)을 포함하거나 엑소좀을 포함하지 않는 U87 세포, 2x105를 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.U87 세포 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었고, U87 세포는 4°C에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정된 다음 Leica TCS SP8 STED CW 공초점 현미경 시스템(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)에서 분석되었습니다.주목할 만한.
cDNA는 Mir-X siRNA 첫 번째 가닥 합성 및 SYBR qRT-PCR 키트(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 siRNA로부터 합성되었습니다.실시간 정량 PCR은 SYBR Premix와 혼합된 프라이머 및 템플릿을 사용하여 iQ5 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수행되었습니다.DNA는 95°C에서 15초 동안 변성 및 60°C에서 60초 동안 어닐링하는 40주기 동안 증폭되었습니다.iQ™5 광학 시스템 소프트웨어(Bio-Rad)의 데이터 분석 모듈을 사용하여 각 PCR 반응의 데이터를 분석했습니다.선택된 표적 유전자와 β-액틴/siRNA(및 U6) 사이의 유전자 발현의 상대적인 변화는 표준 곡선 방법을 사용하여 계산되었습니다.사용된 프라이머 서열은 표 1에 제시되어 있다.
3 x 104개의 U87 신경아교종 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 대조군으로서 BV2(50μg/mL)에서 유래한 톡소플라스마 감염 엑소좀 또는 BV2(50μg/mL)에서 유래한 무맥동 엑소좀과 12, 18 및 36시간에 혼합했습니다. .세포 증식률은 Cell Counting Kit-8(Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 결정되었습니다(보조 그림 S1-S3) 46 .
5주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스를 Orient Bio(대한민국 성남시)에서 구입하여 실온(22±2°C) 및 습도(45±15°C)의 무균 우리에 개별적으로 보관하였다.%) 실온(22±2°C) 및 습도(45±15%)에서.12시간 명주기와 12시간 암주기는 SPF(서울대학교 의과대학 동물센터)에서 시행하였다.마우스를 무작위로 각각 5마리씩 세 그룹으로 나누고 모든 그룹에 1 x 107 U87 신경아교종 세포 및 성장 인자 감소 BD Matrigel™(BD Science, Miami, FL, USA)을 함유하는 PBS 400ml를 피하 주사했습니다.종양 주사 6일 후, BV2 세포(톡소플라즈마 감염 유무에 관계없이)에서 유래한 엑소좀 200mg을 종양 부위에 주사했습니다.종양 감염 22일 후, 각 그룹의 마우스의 종양 크기를 주 3회 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피는 0.5×(너비)×2×길이로 계산하였다.
miRCURYTM LNA miRNA 어레이를 사용한 MicroRNA 발현 분석, 7세대 has, mmu 및 rno 어레이(EXIQON, Vedbaek, Denmark)는 3100개의 인간, 마우스 및 래트 miRNA 포획 프로브 중 1119개의 잘 특성화된 마우스를 포함합니다.이 과정에서 총 RNA 250~1000ng을 송아지 장 알칼리 포스파타제로 처리한 후 Hy3 녹색 형광 염료로 표지하여 5'-포스페이트에서 제거했습니다.그런 다음 혼성화 챔버 키트(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 및 혼성화 슬라이드 키트(Agilent Technologies)를 사용하여 마이크로어레이 슬라이드를 로딩하여 라벨링된 샘플을 혼성화했습니다.혼성화를 56℃에서 16시간 동안 수행한 다음 마이크로어레이를 제조업체의 권장 사항에 따라 세척했습니다.처리된 마이크로어레이 슬라이드는 Agilent G2565CA 마이크로어레이 스캐너 시스템(Agilent Technologies)을 사용하여 스캔되었습니다.Agilent Feature Extraction 소프트웨어 버전 10.7.3.1(Agilent Technologies)을 사용하여 스캔한 이미지를 가져오고 수정된 Exiqon 프로토콜의 해당 GAL 파일을 사용하여 각 이미지의 형광 강도를 정량화했습니다.현재 연구를 위한 마이크로어레이 데이터는 수탁 번호 GPL32397로 GEO 데이터베이스에 기탁되어 있습니다.
톡소플라즈마에 감염된 RH 또는 ME49 균주의 미세아교세포에서 성숙한 엑소좀 miRNA의 발현 프로필을 다양한 네트워크 도구를 사용하여 분석했습니다.종양 발달과 관련된 miRNA는 miRWalk2.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)을 사용하여 확인되었고 8.0보다 큰 정규화된 신호 강도(log2)로 필터링되었습니다.miRNA 중에서 차별적으로 발현된 miRNA는 T. gondii에 감염된 RH 또는 ME49 균주에 의해 변경된 miRNA의 필터 분석에 의해 1.5배 이상 변경된 것으로 밝혀졌습니다.
세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 opti-MEM(Gibco, Carlsbad, CA, USA)의 6-웰 플레이트(3 x 105 세포/웰)에 시딩하였다.형질감염된 세포를 6시간 동안 배양한 후 배지를 새로운 완전 배지로 교체하였다.형질감염 24시간 후에 세포를 수확하였다.
통계분석은 주로 Excel 소프트웨어(Microsoft, Washington, DC, USA)를 이용한 Student's t-test를 이용하여 수행하였다.실험 동물 분석을 위해 Prism 3.0 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 양방향 ANOVA를 수행했습니다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义. P < 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
이 연구에 사용된 모든 실험 프로토콜은 서울대학교 의과대학 임상심사위원회(IRB number SNU-150715-2)의 승인을 받았습니다.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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