십이지장편모충은 설사의 임상 징후가 있는 어린 소아에게 특히 흔한 장 감염인 편모충증을 유발하는 기생충입니다.우리는 이전에 세포외 G. duodenalis가 세포내 올리고머화 유사 수용체 3(NLRP3) 결합 뉴클레오티드의 활성화를 유발하고 세포외 소포(EV) 분비를 통해 숙주 염증 반응을 조절한다고 보고했습니다.그러나 이 과정에 관여하는 병원체 관련 십이지장 구균 EV(GEV)의 정확한 분자 패턴과 편모충증에서 NLRP3 인플라마좀의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.
GEV의 재조합 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-2 및 알파-7.3 지아딘을 제작하고, 마우스 일차 복막 대식세포에 형질감염시키고, 염증 표적 분자 카스파제-1을 측정하여 검출했습니다.p20 발현 수준이 스크리닝되었습니다..G. duodenalis alpha-2 및 alpha-7.3 giardine은 원래 NLRP3 inflammasome(NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 및 caspase-1 p20), IL 분비를 측정하여 식별되었습니다.1β 수준, ASC(세포자멸사 발견 단백질) 올리고머화 수준, NLRP3 및 ASC의 면역형광 위치.그런 다음 G. duodenalis의 병원성에서 NLRP3 인플라마좀의 역할을 NLRP3 활성화가 차단된 마우스(NLRP3 차단 마우스)를 사용하여 평가하고 체중, 십이지장 기생충 부하 및 십이지장 조직의 병리학적 변화를 모니터링했습니다.또한, 우리는 히아르딘 알파-2와 알파-7.3이 NLRP3 인플라마좀을 통해 생체 내에서 IL-1β 분비를 유도하는지 여부를 조사하고 생쥐에서 G. duodenalis의 병원성에서 이들 분자의 역할을 결정했습니다.
알파-2 및 알파-7.3 지아딘은 시험관 내에서 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 유도합니다.이는 p20 카스파제-1의 활성화, NLRP3, pro-IL-1β 및 프로-카스파제-1 단백질의 발현 수준 증가, IL-1β 분비의 상당한 증가, ASA 반점의 형성으로 이어졌습니다. 세포질 및 ASA 올리고머화 유도.NLRP3 염증 음경 손실은 생쥐에서 G. duodenalis의 병원성을 악화시킵니다.NLRP3 차단된 생쥐의 위관 영양법으로 낭종을 치료한 생쥐는 영양체의 수가 증가하고 십이지장 융모에 심각한 손상을 보였으며, 이는 수축되고 분지된 괴사선와를 특징으로 합니다.생체 내 실험에서는 지아딘 알파-2와 알파-7.3이 NLRP3 인플라마솜을 통해 IL-1β의 분비를 유도할 수 있으며 지아딘 알파-2와 알파-7.3으로 면역화하면 생쥐에서 G. duodenalis의 병원성을 감소시키는 것으로 나타났습니다.
종합하면, 이 연구의 결과는 지아르디아 알파-2와 알파-7.3이 숙주 NLRP3 염증의 상향 조절을 일으키고 생쥐에서 G. duodenalis의 감염성을 감소시키는 것을 시사하며, 이는 편모충증 예방을 위한 유망한 표적입니다.
십이지장편모충은 소장에 서식하는 세포외 원생동물 기생충으로, 특히 개발도상국의 어린 아이들에게 매년 설사와 함께 2억 8천만 건의 편모충증을 유발합니다[1].사람들은 M. 십이지장 낭종에 오염된 식수나 음식을 통해 감염되며, 이후 위장으로 들어가 위액으로 배설됩니다.십이지장 영양체는 십이지장 상피에 부착되어 메스꺼움, 구토, 설사, 복통, 체중 감소를 유발합니다.면역결핍 및 낭포성 섬유증이 있는 개인은 감염되기 쉽습니다.구강 및 항문 성교를 통해서도 감염이 발생할 수 있습니다[2].메트로니다졸, 티니다졸, 니타족사니드 등의 약물이 십이지장 감염에 선호되는 치료 옵션입니다[3].그러나 이러한 화학요법 약물은 오심, 발암, 유전독성 등의 부작용을 일으킨다[4].따라서 G. duodenalis 감염을 예방하기 위해서는 보다 효과적인 전략을 개발할 필요가 있습니다.
인플라마솜은 선천성 면역 반응의 일부인 세포질 단백질 복합체의 일종으로, 병원체 침입을 방어하고 염증 반응을 중재하는 데 도움을 줍니다[5].이러한 염증복합체 중 NOD(뉴클레오티드 결합 올리고머화) 수용체 3(NLRP3) 뉴클레오티드 결합 올리고머화(NLRP3) 뉴클레오티드 결합 유사 염증복합체는 다양한 병원체/손상 관련 분자 패턴(PAMP/ DAMP)는 선천성 면역 체계를 인식하고 활성화합니다.많은 염증성 질환에서 장의 항상성을 조절합니다 [6,7,8].이는 패턴 인식 수용체(PRR) NLRP3, 어댑터 세포사멸 점박이 단백질(ASC) 및 이펙터 프로카스파제-1 또는 프로카스파제-11로 구성됩니다.NLRP3 인플라마솜은 Neospora caninum[9], Paracoccidioides brasiliensis[10] 및 Leishmania 연구에서 관찰된 바와 같이 병원체 침입에 대한 숙주 역할을 합니다.[11], 그러나 NLRP3 인플라마솜의 활성화는 보호 면역 반응을 제한하고 예를 들어 벌레에서 질병 진행을 악화시키는 것으로 보고되었습니다[12].이전 연구 결과를 바탕으로 우리는 세포외 G. duodenalis가 NLRP3 염증의 세포내 활성화를 유발하고 세포외 소포(EV)를 분비하여 숙주 염증 반응을 조절한다고 보고했습니다.그러나 생체 내 G. duodenalis 감염에서 NLRP3 inflammasome의 역할은 아직 결정되지 않았습니다.
지아딘은 원래 G. duodenalis 세포골격의 구조적 구성요소로 설명되었으며 소장에서 영양체 운동성과 상피세포 부착에 중요한 역할을 합니다.환경에 더 잘 적응하고 병원성을 높이기 위해 G. duodenalis 영양체는 8개의 편모, 1개의 중간체, 1개의 복부 디스크로 구성된 독특한 세포골격 구조를 개발했습니다.십이지장편모충의 영양체는 세포골격을 사용하여 소장 상부, 특히 십이지장을 관통하여 장세포에 부착됩니다.그들은 세포 대사를 통해 끊임없이 이동하여 상피 세포에 부착됩니다.따라서 세포골격과 독성 사이에는 밀접한 관계가 있습니다.십이지장편모충에 특이적인 지아르딘은 세포골격 구조의 구성요소이며 [15] α-, β-, γ- 및 δ-지아르딘의 4개 클래스로 나뉩니다.α-지아딘 계열에는 21개의 구성원이 있으며, 이들 모두는 인지질을 결합하는 칼슘 의존적 능력을 가지고 있습니다[16].그들은 또한 세포골격을 세포막에 연결합니다.G. duodenalis로 인한 설사 환자의 경우, α-지아딘은 감염 중에 고도로 발현되고 면역반응을 나타냅니다[17].Giardia alfa-1에 기반한 이종 백신은 생쥐의 편모충증으로부터 보호되었으며 백신 개발을 위한 잠재적인 후보 항원입니다[18].원형질막과 편모에 국한되어 있지만 복부 디스크에는 없는 알파-8 지아딘은 G. duodenalis의 영양체의 운동성과 성장 속도를 향상시킵니다.Alpha-14 지아딘은 편모의 미세소관 구조에 부착되어 G. duodenalis의 생존능력에 영향을 미칩니다[20].알파-11 지아딘은 생활사 전반에 걸쳐 풍부하게 존재하며, 알파-11 지아딘의 과발현은 G. duodenalis 자체에 손상을 줍니다[21].그러나 알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아르딘이 G. duodenalis 감염과 그 기본 메커니즘을 보호하는지 여부는 불분명합니다.
이 연구에서는 재조합 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine과 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine을 마우스의 일차 복막 대식세포에 형질감염시켜 숙주 NLRP3를 활성화시켰습니다.그런 다음 인플라마솜 표적을 스크리닝했습니다.우리는 또한 G. duodenalis의 병원성에서 NLRP3 인플라마솜의 역할을 평가하고, 알파-2 및 알파-7,3 지아르딘이 생체 내에서 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 유도하는지 여부를 조사했으며, G. duodenalis의 병원성에서 지아르딘의 이 두 가지 역할을 확인했습니다. G. 십이지장.우리의 공통 목표는 G. duodenalis 감염 예방을 위한 유망한 표적을 개발하는 것이었습니다.
5~8주령의 야생형(WT) C57BL/6 암컷 마우스는 Liaoning Changsheng Experimental Animal Center(Liaoning, China)에서 구입했습니다.마우스는 물에 자유롭게 접근할 수 있었고 멸균된 음식을 제공받았으며 12/12시간 명/암 주기로 유지되었습니다.감염 전, 생쥐는 암피실린(1mg/mL), 반코마이신(1mg/mL), 네오마이신(1.4mg/mL)(모두 중국 상하이에서 구입, 인공 유기체)이 보충된 식수에 항생제를 자유롭게 투여했습니다. ].].24시간 이상 먹고 마시는 능력을 상실하고 체중의 20% 이상 감소한 마우스를 경추 탈구로 인도적으로 안락사시켰습니다.
WB G. duodenalis 영양체(American Type Culture Collection, Manassas, USA)에 12.5% ​​소 태아 혈청(FBS; Every Green, Zhejiang, China) 및 0.1% 소 담즙(Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA)을 보충했습니다. ).미국) 미세호기성 조건 하에서.합류 영양체를 얼음 위에서 수집하고 추가 재생산을 위해 1:4의 비율로 계대배양했습니다.
십이지장 편모충 낭종은 이전에 설명한 대로 유도되었으며[23], 영양체는 대수 단계에서 수확된 후 캡슐화 유도 배지, pH 7.1(수정된 TYI-S-33)로 최종 농도 1 x 106 영양체/mL로 희석되었습니다.담즙 농도 0.05% 중간).영양체는 로그 성장 단계까지 37°C의 혐기성 조건에서 배양되었습니다.배지를 낭종 유발 배지(pH 7.8, 1% 담즙 농도의 변형 TYI-S-33 배지)로 변경하고 G. duodenalis를 37°C에서 48~96시간 동안 배양하는 동안 현미경으로 낭종 형성을 관찰했습니다.대부분의 영양체가 유도되어 포낭을 형성한 후, 배양 혼합물을 수확하고 멸균 탈이온수에 재현탁하여 나머지 영양체를 용해시켰습니다.낭종을 세어 마우스의 위관을 통한 후속 분석을 위해 4°C에 보관했습니다.
Giardia 세포밖 소포체(GEV)는 이전에 설명한 대로 농축되었습니다[13].대수 성장 단계의 영양체를 엑소좀이 고갈된 FBS(Biological Industries, Beit-Haemek, Israel)로 제조된 변형 TYI-S-33 배지에 최종 농도가 1 x 106 기생충/mL가 되도록 재현탁하고 12시간 동안 배양했습니다.2000g에서 10분, 10,000g에서 45분, 100,000g에서 60분 동안 원심분리하여 배양 상청액으로부터 분리했습니다.침전물을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 정량화하고 -80℃에 보관하거나 추가 분석을 위해 직접 사용했습니다.
일차 마우스 복막 대식세포는 이전에 설명한 대로 준비되었습니다[24].간략하게, 마우스(6-8주령)에게 2.5ml의 2.98% Difco 액체 티오글리콜 배지(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 복강내 주사하고 3-4구개로 먹였습니다.안락사 후 마우스의 복강에서 대식세포 현탁액을 수집하고 1000g에서 10분간 3회 원심분리했습니다.수확된 세포는 세포 순도가 >98%가 될 때까지 CD11b 마커를 사용하는 유동 세포측정법으로 검출한 후 6웰 세포 배양 플레이트(4.5 x 106개 세포/웰)에 첨가하고 37°C에서 10% FBS(Bioindustry)와 함께 배양했습니다.그리고 5% CO2.
TRIzol 시약 (Vazyme, Nanjing, China) 1ml에서 1 × 107 영양체로부터 RNA를 추출하고 MonScript dsDNase (Monad, 중국 우한)를 사용하여 전체 G. duodenalis RNA에서 게놈 DNA를 추출하고 상보적인 DNA (cDNA)를 합성했습니다. 제조업체의 지침에 따라 MonScript RTIIII Super Mix(Monad)를 사용합니다.
표적 G. duodenalis 유전자에 대한 CDS 서열 정보는 NCBI GenBank에서 얻었습니다.Primer 5.0을 사용하여 각 표적 유전자에 대한 특정 심리스 클로닝 프라이머를 디자인하십시오.정방향 프라이머(5'-3')는 선형화된 벡터 pcDNA3.1(+) EcoRV(TGGTGGAATTCTGCAGAT)와 시작 코돈 ATG 및 GNN(첫 번째 염기가 G가 아닌 경우)이 있는 중첩 서열의 세 부분으로 구성됩니다.이는 표현의 효율성을 높이기 위해 수행됩니다.또한 최소 16bp 결합 염기(GC 함량 40~60%/Tm 약 55°C).역방향 프라이머(5'-3')는 EcoRV 선형화된 벡터 pcDNA3.1(+)(GCCGCCACTGTGCTGGAT)과 최소 16bp의 결합된 염기의 중첩 서열 두 부분으로 구성됩니다.(마지막 두 정거장 제외)염기) 재조합 플라스미드가 표지된 단백질을 발현할 수 있도록 하는 AA 또는 GA와 같은 코돈).프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있으며 Kangmet Biotechnology Co., Ltd.(중국 창춘)에서 합성되었습니다.
준비된 G. duodenalis cDNA를 주형으로 사용하여 Pfu DNA 중합효소(Tiangen, Beijing, China) 또는 Ex-taq(Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China)를 사용하여 표적을 증폭시켰습니다.진핵생물 발현 벡터 플라스미드 pcDNA3.1(+)를 제한 효소 EcoRV로 선형화하고 Fast AP(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 탈인산화시켰습니다.선형화된 pcDNA3.1(+) 단편과 증폭된 표적 유전자 단편을 DNA 겔 정제 키트(Tiangen)를 사용하여 정제하고 Nanodrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량화했습니다.pcDNA3.1(+) 단편과 각 표적 유전자 단편을 MonClone 단일 조립 클로닝 믹스(Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China)를 사용하여 재조합하고 Comate Bioscience Company Limited(Changchun, China)를 사용하여 DNA 서열분석을 통해 확인하였다..
내독소가 없는 플라스미드 pcDNA3.1(+)-alpha-2 및 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3은 SanPrep 내독소가 없는 플라스미드 미니 키트(Sangon Biotech)를 사용하여 생성되었습니다.용출 완충액의 EDTA가 형질감염 분석을 방해하지 않도록 농도를 500ng/μl 이상으로 유지했습니다.1차 마우스 복막 대식세포를 완전 RPMI 1640 배지(Biological Industries)가 포함된 6웰 플레이트에서 12시간 동안 배양한 후 세포를 따뜻한 PBS로 3회 세척하여 페니실린과 스트렙토마이신을 제거한 다음 완전 배지가 보충된 배지에서 세척했습니다.내독소가 없는 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-2 및 pcDNA3.1(+)-알파-7.3(2.5μg)을 Opti-MEM 환원 혈청 배지(Gibco, Thermo Fisher Scientific) 125μl에 희석했습니다..그런 다음 Lipofectamine 2000 형질감염 시약(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 5μl를 저혈청 Opti-MEM 배지 125μl에 희석했습니다.희석된 내독소가 없는 플라스미드를 Lipofectamine 2000과 혼합하고 혼합물을 실온에서 5분 동안 방치하여 리포솜-DNA 복합체를 준비합니다.복합체를 각 웰의 세포에 별도로 옮기고 천천히 섞습니다.4시간 후, 세포배양배지를 완전 RPMI 1640 배지 2ml로 교체하고 24시간 동안 배양을 계속하였다.신선한 세포 배양 배지를 세포에 첨가하고 분석 설계에 따라 다양한 시점 동안 배양했습니다.
상청액 및 세포 용해물로부터의 단백질 샘플은 이전에 설명한 대로 준비되었습니다[25].pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin 및 His-tag에 대한 막 전달 매개변수는 200mA/90분이었습니다.인터루킨 1β(IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), 카스파제-1(p20)(Adipogen, 스위스) 및 NLRP3(Adipogen SA, Epalinges, 스위스) 및 His 태그를 표적으로 하는 1:5000(Amylet Scientific, 우한, 중국) 및 β-액틴(Proteintech, 우한, 중국).
DSS(disuccinimide suberate)와의 가교는 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[26].세포를 차가운 PBS로 3회 세척하고 25mM Na2PO4, 187.5mM NaCl, 25mM HEPES 및 125mM NaHCO3를 함유한 50μl ASC 반응 완충액(pH 8.0)에서 27게이지 바늘로 완전히 용해시켰습니다.혼합물을 5000g에서 3분 동안 원심분리하고 펠렛을 10μl DSS(DMSO 중 25mM) 및 40μl ASC 반응 완충액으로 37°C에서 30분 동안 봉합했습니다.5000 g에서 10분간 원심분리한 후, 펠릿을 ASC 반응 완충액 40 μl와 6x 단백질 로딩 완충액(TransGen, Beijing, China) 10 μl 용액에 녹인 후 실온에서 15분간 quenching하였다. 분., 그런 다음 10분간 끓입니다.그런 다음 단백질 샘플을 1차 항-ASC 항체(Wanleibio, Shenyang, China)를 1:500의 희석 비율로 사용하여 Western blotting에 적용했습니다.
이전에 설명한 절차에 따라[13], 세포 배양 상층액을 수집하고 마우스 IL-1 베타 ELISA 키트(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 염증성 사이토카인 IL-1β의 분비를 측정했습니다.IL-1β 표준 곡선을 사용하여 OD450nm 값을 단백질 농도로 변환합니다.
커버슬립에 코팅된 세포를 따뜻한 PBS에서 3회 부드럽게 세척하고 조직 세포 고정액(Biosharp, Beijing, China)에 실온(RT)에서 10분 동안 100%의 0.1% Triton X-Permeabilize(PBS에 희석, Biosharp)에 고정했습니다. ) 실온에서 20분 동안 차단하고 5% 소 혈청 알부민(PBS 중)에서 실온에서 2시간 동안 차단합니다.그런 다음 세포를 각각 ASC(1:100 희석) 또는 NLRP3(1:100 희석)에 대한 1차 항체 및 Cy3 표지 염소 항토끼 IgG(H+L)(1:400; EarthOx)와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다. , San Francisco, CA, USA) 또는 FITC-접합 염소 항-마우스 IgG(1:400; Earthox)를 37°C 암실에서 1시간 동안 하룻밤 동안 사용했습니다.핵을 Hoechst 33258(10μg/ml; UE, Suzhou, China)로 5분 동안 염색하고 형광 현미경(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)으로 관찰했습니다.
마우스를 4개 그룹으로 나누었습니다(각 그룹당 n=7): (i) PBS 처리 음성 대조군(PBS만; 위관 영양법 100μl/마우스 PBS에 이어 3시간 후 매일 100μl/마우스 PBS를 복강내 주사)., 7일 동안 지속적으로);(ii) MCC950 억제제[27]로 처리된 음성 대조군(PBS 위관 영양법을 통해 마우스당 100μl, 3시간 후, 10mg/kg 체중[BW] MCC950[PBS]을 매일 복강 내 투여, 7일 지속);(iii) G. 십이지장낭종 감염군(위관 영양법으로 1.5 x 106개 낭종/마우스, 3시간 후, 100μl/마우스 PBS를 7일 동안 매일 복강내 투여);(iv) G. 십이지장낭종 복합 감염군 MCC950 억제제 치료군(위관 영양법을 통해 1.5×106개 낭종/마우스, 3시간 동안 7일 동안 매일 복강 내 10mg/kg 체중 MCC950).각 마우스의 체중을 매일 모니터링하고 모든 마우스를 7일째 안락사시켰습니다.수확된 십이지장(3 cm 길이)을 1 ml PBS에서 작은 조각으로 자르고, 낭종을 4°C PBS 및 G. duodenalis 영양체에서 밤새 파괴했습니다.헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 신선한 십이지장(길이 1cm)을 분리했습니다.
마우스를 (i) MOCK 대조군과 (ii) MCC950 억제제 그룹의 두 그룹으로 나누었습니다.각 그룹에는 5가지 치료가 있었습니다(n = 7/치료 그룹): (i) PBS 치료 음성 대조군(PBS 단독; 100μl/마우스 PBS, 근육내(IM) 주사(전경골근)[28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) 플라스미드 음성 대조군(100μg/마우스 DNA, 근육내 주사를 통해) (iii) G. 십이지장 포낭 감염 양성 대조군(1.5 x 106개 낭종/마우스, 위관 영양법을 통해) (iv) a 플라스미드 pcDNA3.1(+)-alpha-2(100μg/마우스 DNA, 근육내 주사)로 처리한 그룹 및 (v) 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-7.3(100μg/마우스)으로 처리한 그룹 DNA에 따르면, 12시간 계대 후, MCC950 억제제 그룹의 마우스는 MCC950(10mg/kg 체중)을 7일 동안 매일 복강내 주사받았고, MOCK 그룹의 마우스는 동일한 양의 PBS 처리를 받았습니다. 혈액 샘플은 안구 마우스로부터 수집하고 4°C에서 밤새 방치했습니다. IL-1β 수준에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 혈청 샘플을 분리했습니다.
35마리의 마우스를 5개의 그룹으로 나누었습니다(n=7/그룹).그룹 1은 PBS로 처리된 음성 대조군이었습니다. 마우스는 100μl의 PBS를 근육내로 투여받았고 3일 후에 위관 영양법으로 투여받았습니다.그룹 2는 G. duodenalis 낭종에 감염된 양성 대조군입니다. 마우스에 PBS 100μl를 주사하고 3일 후 1.5 x 106개 낭종/마우스를 위내 주사했습니다.세 번째 그룹 – 십이지장 낭종 감염에 대한 대조군과 함께 pcDNA3.1(+)를 이용한 플라스미드 면역화: 마우스는 여러 번에 걸쳐 100μg의 플라스미드 DNA pcDNA3.1(+)(im)을 경구로 투여받았습니다. 1.5×106 낭종/마우스 3 날.그룹 4와 5는 G. duodenalis 낭종 감염과 결합된 재조합 pcDNA3.1(+)-알파-2 지아딘 플라스미드 또는 pcDNA3.1(+)-알파-7.3 지아딘 플라스미드였습니다.실험군: 쥐에게 100μg의 pcDNA3을 투여했습니다.1(+)-지아딘 플라스미드 DNA(im)를 주입한 후 3일 후 1.5 x 106개 낭종/마우스를 위관 영양법으로 주입했습니다.G. duodenalis 낭종을 튜브를 통해 도입한 후 각 마우스의 체중을 모니터링했습니다.기생충 부하 측정 및 HE 염색 분석을 위해 신선한 십이지장을 수집했습니다.
조직병리학적 변화는 이전에 발표된 절차에 따라 분석되었습니다[30].신선한 십이지장을 조직 세포 고정제로 고정하고, 파라핀에 포매하고, 4 μm 섹션으로 자르고, H&E로 염색하고 광학 현미경으로 분석했습니다.7마리의 독립적인 생쥐의 7개 조직 절편에서 나타나는 대표적인 병리학적 변화는 치료에 대해 알지 못하는 병리학자에 의해 평가되었으며 200x 배율로 포착되었습니다.융모의 길이와 선와의 깊이는 이전에 설명한 방법에 따라 측정되었습니다.
시험관 내 및 생체 내 결과는 3회 반복해서 얻어졌습니다.GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 그래프를 생성했습니다.두 그룹 간의 차이는 t-테스트로 분석하였고, 3개 이상의 그룹 간의 차이는 SPSS 소프트웨어(버전 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석했습니다.Levene의 테스트와 Bonferroni의 사후 테스트(B)를 사용하여 데이터의 분산 동질성을 분석했습니다.유의성은 P<0.05, P<0.01, P<0.001(유의하지 않음[ns])(P>0.05)로 표현됩니다.
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)의 GEV 단백질체학에 대한 이전 분석에서는 많은 표적이 염증 신호 전달 경로의 활성화에 관여할 수 있음을 보여주었습니다[13].우리는 두 가지 유망한 표적인 알파-2와 알파-7.3 지아딘을 선택하여 이들 분자를 증폭하고 이를 사용하여 pcDNA3.1(+) 진핵생물 발현 벡터를 구성했습니다.시퀀싱 후, 재조합 pcDNA3.1(+)-알파-2 및 알파-7.3 지아딘 발현 플라스미드를 일차 마우스 복막 대식세포에 형질감염시켰고, 염증의 카스파제-1 p20 시그니처 단백질(활성화된 카스파제-1의 단편)이 확인되었습니다. 염증을 유발할 수 있는 핵심 분자를 ​​밝히는 것입니다.결과는 알파-2 및 알파-7.3 지아르딘이 GEV와 유사한 p20 카스파제-1 발현을 유도할 수 있음을 보여주었습니다.처리되지 않은 음성 대조군(PBS만 해당) 및 플라스미드 대조군 pcDNA3.1(+)(그림 1)에서는 카스파제-1 활성화에 대한 효과가 발견되지 않았습니다.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 및 alpha-7.3 giardins에 의한 p20 카스파제-1 활성화 측정.재조합 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-2 및 알파-7.3 지아르딘(각 레인 위)을 1차 마우스 복막 대식세포에 형질감염시키고 24시간 후에 배양 상층액을 수확했습니다.Western blotting을 사용하여 대표적인 caspase-1 p20 inflammasome 단백질의 발현 수준을 측정했습니다.음성대조군은 PBS 단독 처리군(레인 C)과 pcDNA3.1(+) 단독치료군(pcDNA3.1 레인)을, 양성대조군은 GEV 처리군을 사용하였다.재조합 단백질의 발현은 각 단백질의 히스티딘 태그를 검출하여 확인하였고, 예상되는 단백질 밴드는 알파-2 지아르딘(38.2 kDa) 및 알파-7.3 지아르딘(37.2 kDa)이었다.GEV, 십이지장편모충 세포밖 소포체, pcDNA3.1(+), EcoRV-선형 벡터, SUP, 상층액
알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아르딘이 p20 카스파제-1 발현을 유도하고 숙주 NLRP3 염증 반응을 활성화하는 역할을 하는지 확인하기 위해 pcDNA3.1(+)-알파-2 지아르딘과 pcDNA3.1(+)-알파 -7.3 지아딘을 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 일차 마우스 복막 대식세포에 형질감염시켰고, 주요 염증성 단백질인 NLRP3의 발현 수준, 국소화 및 올리고머화를 결정했습니다.본 실험에서는 양성대조군으로 GEV를 사용하였으며, 음성군은 무처리군(PBS만) 또는 pcDNA3.1(+) 형질감염군을 사용하였다.결과는 GEV 그룹에서와 마찬가지로 지아딘 pcDNA3.1(+)-알파-2와 지아딘 pcDNA3.1(+)-알파-7.3의 재조합 플라스미드 DNA가 NLRP3, pro-IL-1β 및 procaspase-1 및 caspase-1 활성화 (그림 2a).또한, 두 지아딘 모두 유의미한 IL-1β 분비를 유도했습니다(pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; 알파-2 지아딘: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;알파-7.3 지아르딘: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047)(그림 2b).대부분의 ASC 단백질은 pcDNA3.1(+)-알파-2 또는 pcDNA3.1(+)-알파-와는 대조적으로, 처리하지 않은 그룹 또는 pcDNA3.1(+) 플라스미드로 형질감염된 처리 그룹에서 단량체였습니다. 7.3 지아르딘.ASC 올리고머화는 GEV 양성 대조군 그룹 또는 그룹의 재조합 플라스미드 DNA에서 발생하여 올리고머 형태를 나타냅니다(그림 2c).이러한 예비 데이터는 알파-2 지아르딘과 알파-7,3 지아르딘이 NLRP3 염증 활성화를 유도할 수 있음을 시사합니다.ASC와 NLRP3의 국소화에 대한 후속 면역형광 연구에서는 음성 대조군에서 ASC 단백질이 세포질 전체에 흩어져 있고 pcDNA3.1(+)-alpha-2를 지아딘 또는 pcDNA3으로 자극하면 점 신호로 나타나는 것으로 나타났습니다.1(+)-alpha-7,3 giardine 그룹 또는 GEV 양성 대조군(그림 2d).음성 대조군과 플라스미드를 처리한 pcDNA 3.1 그룹에서는 NLRP3 단백질 신호가 검출되지 않은 반면, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine 또는 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3에 반응하여 형광 신호 점이 나타납니다. 감지되었습니다..지아딘은 세포질이나 HEV 자극시 발견됩니다 (그림 2e).이러한 데이터는 G. duodenalis giardin 알파-2와 giardin 알파-7.3이 마우스의 일차 복막 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜을 활성화한다는 것을 추가로 보여줍니다.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin과 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin은 마우스 복막 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜을 활성화합니다.재조합 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-2 지아르딘 및 pcDNA3.1(+)-알파-7.3 지아르딘을 1차 쥐 복막 대식세포 및 세포로 형질감염시키거나 발현, 올리고머화 분석을 위해 24시간 이내에 상층액을 수확합니다. , 분비.주요 염증성 단백질의 국소화.음성대조군은 PBS 단독(C)군과 pcDNA3.1(+) 단일 처리군을 사용하였고, 양성군은 GEV 처리군을 사용하였다.a NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 및 p20 caspase-1을 포함한 주요 염증 단백질 NLRP3은 Western blotting으로 검출되었습니다.b 상층액에서 IL-1β의 분비 수준은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 결정되었습니다.대조군과 실험군 간의 차이는 SPSS 소프트웨어 버전 22.0을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)으로 분석되었습니다.별표는 **P<0.01과 ***P<0.001 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.c 펠릿의 ASC 올리고머화 수준은 DSS 가교 분석에 의해 결정되었으며, 세포 용해물의 ASC 수준은 로딩 제어로 사용되었습니다.d 면역형광을 이용한 ISC 국소화의 시각화.e 면역형광을 사용하여 NLRP3의 위치를 ​​시각화했습니다.ASC, 세포자멸사 반점 유사 단백질;IL, 인터루킨;NLRP3, 뉴클레오티드 결합 올리고머화 유사 수용체 3;ns, 유의미하지 않음(P > 0.05)
G. duodenalis와 이것이 분비하는 GEV는 모두 NLRP3 인플라마솜을 활성화하고 시험관 내에서 숙주 염증 반응을 조절합니다.따라서 G. duodenalis의 병원성에서 NLRP3 inflammasome의 역할은 불분명합니다.이 문제를 조사하기 위해 우리는 G. duodenalis 낭종에 감염된 마우스와 G. duodenalis 낭종 + MCC950 억제제 치료에 감염된 마우스 간의 실험을 설계하고 G. duodenalis 낭종에 감염되었을 때 NLRP3 inflammasome 발현을 비교했습니다.실험의 자세한 계획은 그림 3a에 나와 있습니다.다양한 치료군에서 마우스의 체중 변화를 낭종 감염 후 7일 동안 모니터링하였고, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.순수 PBS로 처리한 그룹과 비교하여, 결과는 (i) G. duodenalis 낭종에 감염된 마우스의 체중이 감염 후 3일부터 7일까지 감소했으며;(ii) MCC950 억제제를 사용한 치료는 마우스의 체중에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다..단일 감염군에 비해 MCC950을 처리한 십이지장 감염군의 BW는 다양한 정도로 감소했다(1일차: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P=0.0148; 2일차: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; 3일차: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; 4일차: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052; 5일차: ANOVA, F (3, 24)=0.6497, P=0.0645; 6일차: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; 7일차: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).이러한 데이터는 NLRP3 인플라마솜이 십이지장 감염의 초기 단계(2~4일)에 쥐의 상당한 체중 감소를 방지한다는 것을 보여줍니다.그런 다음 우리는 십이지장 세척액에서 G. duodenalis 영양체를 검출하는 것을 목표로 했으며 그 결과는 그림 3c에 나와 있습니다.G. duodenalis 낭종 감염군과 비교하여, NLRP3 inflammasome을 차단한 후 십이지장의 영양체 수가 유의하게 증가했습니다(t(12) = 2.902, P = 0.0133).HE로 염색된 십이지장 조직은 PBS 및 MCC950 단독으로 처리된 음성 대조군과 비교하여 다음과 같이 나타났습니다: (i) G. 십이지장 낭종 감염은 십이지장 융모에 손상을 초래했습니다(ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P=0.0488) ) 및 크립트 위축(ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) G. duodenalis 낭종에 감염되고 MCC950 억제제로 치료된 생쥐의 십이지장.십이지장 융모는 위축 및 크립트 분기(ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481)로 손상되고 사망했습니다(ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144)(그림 3d- 에프) .이러한 결과는 NLRP3 인플라마솜이 G. duodenalis의 병원성을 감소시키는 역할을 한다는 것을 시사합니다.
십이지장 편모충 감염에서 NLRP3 inflammasome의 역할.마우스에게 십이지장구균 낭종을 위관 영양 공급(iv)한 후 MCC950(ip)을 사용하거나 사용하지 않고 치료했습니다.PBS 또는 MCC950을 사용한 단일 처리 그룹을 대조군으로 사용했습니다.실험군 및 치료 요법.b 다양한 치료 그룹 각각에서 생쥐의 체중을 7일 동안 모니터링했습니다.G. duodenalis 감염군과 G. duodenalis + MCC950 감염 치료군의 차이를 SPSS 소프트웨어 버전 22.0을 이용하여 t-test로 분석하였다.별표는 *P<0.05, **P<0.01 또는 ***P<0.001에서 유의미한 차이를 나타냅니다.c 십이지장 세척액의 영양체 수를 세어 기생충 부하를 결정했습니다.G. duodenalis 감염군과 G. duodenalis + MCC950 감염 치료군의 차이를 SPSS 소프트웨어 버전 22.0을 이용하여 t-test로 분석하였다.별표는 *P < 0.05에서 유의미한 차이를 나타냅니다.d 십이지장 조직병리학의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 결과.빨간색 화살표는 융모의 손상을 나타내고 녹색 화살표는 지하실의 손상을 나타냅니다.스케일 바: 100μm.e, f 십이지장 융모 높이와 마우스 선와 높이의 통계 분석.별표는 *P<0.05 및 **P<0.01에서 유의미한 차이를 나타냅니다.결과는 7개의 독립적인 생물학적 실험에서 얻은 것입니다.BW, 체중;ig, 위내 전달 경로;IP, 복강내 전달 경로;ns, 유의미하지 않음(P > 0.05);PBS, 인산염 완충 식염수;WT, 야생형
IL-1β의 분비는 염증 활성화의 특징입니다.G. duodenalis 알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아르딘이 생체 내에서 NLRP3 숙주 인플라마솜을 활성화하는지 여부를 확인하기 위해 치료되지 않은 WT 마우스(가짜 ​​그룹)와 NLRP3 인플라마솜 차단 마우스(MCC950 억제 치료 그룹)를 사용했습니다.실험의 자세한 계획은 그림 4a에 나와 있습니다.실험 그룹은 PBS, 위관 영양법을 통한 G. duodenalis 낭종 처리, pcDNA3.1의 근육 내 주사 및 pcDNA3.1(+)-alpha-2 지아르딘 또는 pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘의 근육 내 주사로 구성된 마우스로 구성되었습니다.재조합 플라스미드를 근육내 투여한 후 7일째 되는 날 혈청을 채취하여 각 군의 IL-1β 수준을 측정하였다.그림 4b에서 볼 수 있듯이 MOCK 그룹에서는 (i) PBS 그룹과 비교하여 pcDNA3.1 처리가 IL-1β 분비에 유의한 영향을 미치지 않았습니다(ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998). IL-β 분비는 G. duodenalis 낭종 그룹(ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine 및 pcDNA3에서 유의하게 증가했습니다.1- 알파-7.3 지아딘의 근육내 주사는 혈청 IL-1β 수준을 유의하게 증가시켰습니다(ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 지아딘은 pcDNA3.1-alpha-2 지아딘 근육내 주사 그룹에서 높은 수준의 IL-1β 분비를 유도했습니다(ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333). .MCC950 처리군과 MOCK군의 각 군과 비교하면: (i) PBS 대조군과 pcDNA3.1 대조군의 IL-1β 분비 수준은 MCC950 억제제를 차단한 후 어느 정도 감소했지만 차이는 없었다. 유의미함(PBS: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950을 차단한 후.IL-1β 분비는 G. duodenalis 낭종 감염군, pcDNA3.1-alpha-2 giardine 군, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine 군에서 유의하게 감소하였다(G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-알파-2 지아르딘: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘: ANOVA, F(9, 58) ) = 3.540, P = 0.0164).이러한 결과는 알파-2 지아딘과 알파-7.3 지아딘이 생체 내에서 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 매개한다는 것을 시사합니다.
pcDNA3.1(+)-지아딘은 생체 내에서 NLRP3 숙주 염증복합체를 활성화합니다.마우스를 재조합 진핵 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-알파-2 지아르딘 또는 pcDNA3.1(+)-알파-7.3 지아르딘으로 면역화(IM)한 후 MCC950(ip; MCC950 그룹) 처리 여부(모조 그룹) ).PBS 또는 pcDNA3.1(+) 플라스미드 처리군을 음성 대조군으로 사용하였고, G. duodenalis 낭종 처리군을 양성 대조군으로 사용하였다.실험군 및 치료 요법.b 생쥐의 IL-1β 혈청 수준은 ELISA 분석을 통해 7일째에 측정되었습니다.MOCK 그룹 내 그룹 간 차이는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였고, MOCK 그룹과 MCC950 그룹 간의 차이는 SPSS 소프트웨어 버전 22.0의 t-test를 이용하여 분석하였다.별표는 MOCK 그룹의 치료 그룹 사이에 유의한 차이가 있음을 나타냅니다(*P<0.05 및 ***P<0.001).달러 기호($)는 P<0.05에서 MOCK 그룹의 각 그룹과 MCC950 그룹 간의 유의미한 차이를 나타냅니다.7개의 독립적인 생물학적 실험 결과.i, 근육내 주사, ns, 유의미하지 않음(P > 0.05)
G. duodenalis 감염성에 대한 NLRP3 숙주 염증복합체의 알파-2 및 알파-7.3 지아딘 매개 활성화의 효과를 조사하기 위해 우리는 WT C57BL/6 마우스를 사용하고 알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아딘을 주입했습니다.플라스미드는 3일 후에 G. duodenalis 낭종의 위관을 통해 근육내 주사되었고, 그 후 마우스를 7일 동안 관찰하였다.실험의 자세한 계획은 그림 5a에 나와 있습니다.매일 각 마우스의 체중을 측정하였고, 위관을 통해 투여 후 7일째에 신선한 십이지장 조직 샘플을 채취하여 영양체의 수를 측정하고 조직병리학적 변화를 관찰하였다.그림 5b에서 볼 수 있듯이, 수유 시간이 증가함에 따라 각 그룹의 생쥐 BW는 점차 증가했습니다.생쥐의 MT는 G. duodenalis 낭종을 위내 투여한 후 3일째부터 감소하기 시작하다가 점차 증가하였다.알파-2 지아르딘과 알파7.3 지아르딘의 근육 내 주사로 유도된 NLRP3 인플라마좀의 활성화는 생쥐의 체중 감소를 크게 약화시켰습니다(1일차: pcDNA3.1-alpha-2 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0.9754 1일차: pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 2일차: pcDNA3.1-alpha-2 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; 2일차: pcDNA3.1-알파-7.3 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 3일차: pcDNA3.1-알파-2 지아르딘, ANOVA, F( 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 3일차: pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 4일차: pcDNA3.1-alpha-2 지아르딘, ANOVA , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, 4일차: pcDNA3.1-alpha-7.3 지아딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, 5일차: pcDNA3.1-alpha - 2 지아딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 5일차: pcDNA3.1-alpha -7.3 지아딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 6일차: pcDNA3 .1 - 알파-2 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, 6일차: pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7일차: pcDNA3.1-alpha-2 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 7일차: pcDNA3.1-alpha-7.3 지아르딘, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).기생 부하는 십이지장에서 평가되었습니다 (그림 5c).무처리 양성대조군과 빈 pcDNA3.1 벡터를 주입한 군과 비교하여, α-2 지아르딘과 α-7,3 지아르딘(pcDNA3.1-알파)을 주입한 군에서 G. duodenalis 영양체의 수가 유의하게 감소하였다. -2 지아딘: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 지아딘: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).또한, 지아딘 알파-7.3은 지아딘 알파-2(ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081)보다 생쥐에서 더 많은 보호 효과를 보였습니다.HE 염색 결과를 도 1에 나타내었다.5d–f.알파-2 지아딘과 알파-7.3 지아딘을 주사한 쥐는 G. duodenalis를 주사한 쥐와 빈 pcDNA3 벡터와 함께 G. duodenalis를 주사한 쥐에 비해 융모 손상으로 나타나는 십이지장 조직 병변이 더 적었습니다.(pcDNA3.1-alpha-2 지아딘: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 또는 P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 지아딘: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 또는 P = 0.0055) 및 감소된 선와 위축(pcDNA3.1-alpha-2 지아딘: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 또는 P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 지아딘: ANOVA , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 또는 P = 0.0191).이러한 결과는 알파-2 지아르딘과 알파-7,3 지아르딘이 생체 내에서 NLRP3 염증복합체를 활성화함으로써 G. duodenalis의 감염성을 감소시킨다는 것을 시사합니다.
G. duodenalis 감염에서 pcDNA3.1(+)-giardins의 역할.생쥐는 재조합 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)-alpha-2 지아르딘 또는 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 지아르딘으로 면역화(IM)된 다음 G. duodenalis 낭종(ig)으로 감염되었습니다.음성대조군은 PBS군과 pcDNA3.1(+)+십이지장낭종 처리군을, 양성대조군은 십이지장낭종 처리군을 사용하였다.실험군 및 치료 요법.b 다양한 치료 그룹 각각에서 마우스의 MT를 챌린지 후 7일 동안 모니터링했습니다.별표는 G. duodenalis 그룹과 pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine 그룹 간의 유의한 차이(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001)를 나타냅니다.달러 기호($)는 G. duodenalis의 각 그룹과 pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine 그룹 간의 유의미한 차이($$P<0.01 및 $$$P<0.001)를 나타냅니다.c 기생충 부하는 십이지장(길이 3cm)의 십이지장 세척액 1ml에 포함된 영양체 수를 세어 십이지장 cm당 기생충 수로 표시하여 결정했습니다.G. duodenalis 감염군, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine 군, pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine 군 간의 차이를 SPSS 소프트웨어 버전 22.0을 사용하여 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석했습니다.별표는 **P<0.01 및 ***P<0.001에서 유의미한 차이를 나타냅니다.d 십이지장의 조직병리학적 변화.빨간색 화살표는 융모의 손상을 나타내고 녹색 화살표는 지하실의 손상을 나타냅니다.스케일 바: 100μm.e, f 마우스 십이지장 융모 높이(e)와 선와 높이(f)의 통계 분석.그림 1d의 그룹 간의 차이는 SPSS 소프트웨어 버전 22.0을 사용하여 일원 분산 분석으로 분석되었습니다.별표는 *P<0.05 및 **P<0.01에서 유의미한 차이를 나타냅니다.7개의 독립적인 생물학적 실험 결과.ns, 유의미하지 않음(P > 0.05)
십이지장 편모충은 편모충증을 유발하는 인간 및 기타 포유류의 장내 기생충으로 잘 알려져 있습니다.특히 사회 경제적 지위가 낮은 지역사회에서 6년 동안 높은 유병률을 보인 것으로 인해 2004년 WHO 소외 질병 이니셔티브에 포함되었습니다[32].선천성 면역 체계는 G. duodenalis 감염에 대한 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다.마우스 대식세포는 세포외 트랩을 방출하여 G. duodenalis를 삼켜 죽이는 것으로 보고되었습니다[33].우리의 이전 연구에서는 비침습적 세포외 기생충인 G. duodenalis가 마우스 대식세포의 p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 및 NLRP3 염증 신호 전달 경로를 활성화하여 숙주 염증 반응을 조절하고 방출된 GEV가 이 과정을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다.13], 24].그러나 GEV에서 NLRP3 인플라마좀 조절 염증에 관여하는 정확한 PAMP와 편모충증에서 NLRP3 인플라마좀의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.이 두 가지 질문을 밝히기 위해 우리는 본 연구를 수행했습니다.
NLRP3 인플라마솜은 면역세포의 세포질에 위치하며 요산 결정, 독소, 박테리아, 바이러스, 기생충 등 다양한 입자에 의해 활성화될 수 있습니다.박테리아 연구에서 독소는 염증 센서를 활성화하여 염증과 세포 사멸을 유발하는 주요 PAMP로 확인되었습니다[34].Staphylococcus aureus[35] 및 Escherichia coli[36]의 용혈소, 장독소(NHE)의 용혈소신 BL(HBL)[37]과 같은 일부 구조적으로 다양한 독소는 NLRP3 염증의 활성화를 유도합니다.바이러스 연구에 따르면 SARS-COV-2 외피(E) 단백질[38] 및 Zika 바이러스 NS5 단백질[39]과 같은 독성 단백질이 NLRP3 수용체에 의해 인식되는 중요한 PAMP인 것으로 나타났습니다.기생충 연구에서 Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] 및 Leishmania [42]와 같은 많은 기생충이 숙주 염증복합체 활성화와 관련이 있는 것으로 보고되었습니다.Toxoplasma gondii의 독성과 관련된 조밀한 과립 단백질 GRA35, GRA42 및 GRA43은 Lewis 쥐 대식세포에서 파이롭토시스를 유도하는 데 필요합니다[43].또한 일부 리슈마니아 연구에서는 기생충 막 리포포스포글리칸[44] 또는 아연 메탈로프로테아제[45]와 같은 NLRP3 염증복합체와 관련된 개별 분자에 초점을 맞췄습니다.아넥신 유사 알파-지아딘 계열 유전자 중에서 알파-1 지아르딘은 마우스 모델에서 G. duodenalis에 대한 보호를 제공하는 잠재적인 백신 후보인 것으로 나타났습니다 [18].우리 연구에서 우리는 지아르디아에 고유하지만 상대적으로 덜 보고된 G. duodenalis 독성 인자 알파-2 및 알파-7,3 지아르딘을 선택했습니다.염증 활성화 분석을 위해 이들 두 표적 유전자를 pcDNA3.1(+) 진핵생물 발현 시스템 벡터에 클로닝하였다.
우리의 마우스 모델에서 절단된 카스파제 조각은 염증 활성화의 지표 역할을 합니다.자극 시 NLRP3은 ASC와 상호작용하고, 프로카스파제를 모집하고, pro-IL-1β와 pro-IL-18을 각각 성숙한 IL-1β와 IL-18로 절단하는 활성 카스파제를 생성합니다.염증성 카스파제(카스파제-1, -4, -5 및 -11)는 선천적 방어에 중요하고 염증 및 프로그램된 세포 사멸에 관여하는 보존된 시스테인 프로테아제 계열입니다[46].카스파제-1은 표준 염증복합체에 의해 활성화되는 반면[47], 카스파제-4, -5, -11은 비정형 염증복합체가 형성되는 동안 절단됩니다[48].이 연구에서 우리는 마우스 복막 대식세포를 모델로 사용하고 G. duodenalis 감염 연구에서 숙주 NLRP3 염증 활성화의 지표로 p20 caspase-1 절단된 caspase-1을 조사했습니다.결과는 많은 알파-지아딘이 염증의 전형적인 활성화에 책임이 있다는 것을 보여주었는데, 이는 박테리아와 바이러스에 관련된 주요 독성 분자의 발견과 일치합니다.그러나 우리의 연구는 예비 검사일 뿐이며 이전 연구에서 G. duodenalis 감염에서 고전적 및 비고전적 염증복합체를 모두 발견한 것처럼 비고전적 염증복합체를 활성화할 수 있는 다른 분자가 있습니다[13].생성된 p20 카스파제-1이 NLRP3 인플라마솜과 연관되어 있는지 추가로 확인하기 위해 알파-2 및 알파-7.3 지아딘을 마우스 복막 대식세포에 형질감염시켜 주요 분자 단백질 발현 수준과 ASC 올리고머화 수준을 확인하여 두 α-지아딘이 모두 활성화된다는 것을 확인했습니다. 염증복합체 NLRP3.우리의 결과는 G. muris 또는 E. coli EPEC 균주만으로 Caco-2 세포를 자극하면 NLRP3, ASC 및 caspase-1의 형광 강도를 증가시킬 수 있다고 보고한 Manko-Prykhoda 등의 결과와 약간 다릅니다. 비록 유의미하지는 않지만 G. muris와 E. coli의 공동자극이 세 가지 단백질의 수준을 어떻게 증가시켰는가[49].이러한 불일치는 Giardia 종, 세포주 및 일차 세포 선택의 차이로 인해 발생할 수 있습니다.우리는 또한 G. duodenalis에 더 민감한 5주령 암컷 WT C57BL/6 마우스에서 MCC950을 사용하여 생체 내 분석을 수행했습니다.MCC950은 나노몰 농도에서 표준 및 비표준 NLRP3 활성화를 차단하는 강력하고 선택적인 소분자 NLRP3 억제제입니다.MCC950은 NLRP3 활성화를 억제하지만 AIM2, NLRC4 및 NLRP1 염증 경로 또는 TLR 신호 전달 경로의 활성화에는 영향을 미치지 않습니다[27].MCC950은 NLRP3 활성화를 차단하지만 NLRP3 개시, K+ 유출, Ca2+ 유입 또는 NLRP3와 ASC 사이의 상호작용을 억제하지 않습니다.대신 ASC 올리고머화를 차단하여 NLRP3 염증복합체 활성화를 억제합니다[27].따라서 우리는 지아딘 주사 후 NLRP3 인플라마솜의 역할을 결정하기 위해 생체 내 연구에서 MCC950을 사용했습니다.활성화된 카스파제-1 p10은 전염증성 사이토카인인 pro-IL-1β 및 pro-IL-18을 성숙한 IL-1β 및 IL-18로 절단합니다[50].이 연구에서는 MCC950 유무에 관계없이 지아딘을 처리한 생쥐의 혈청 IL-1β 수치를 NLRP3 인플라마솜이 활성화되었는지 여부를 나타내는 지표로 사용했습니다.예상대로 MCC950 치료는 혈청 IL-1β 수준을 크게 감소시켰습니다.이러한 데이터는 G. duodenalis giardin alfa-2와 giardin alfa-7.3이 NLRP3 마우스 염증복합체를 활성화할 수 있음을 명확하게 보여줍니다.
지난 10년 동안 축적된 중요한 데이터에 따르면 IL-17A는 IL-17RA 신호 전달을 유도하고 항미생물 펩타이드를 생성하며 보체 활성화를 조절하는 G. muris에 대한 면역의 주요 조절자라는 것이 입증되었습니다[51].그러나 Giardia 감염은 젊은 성인에서 더 자주 발생하며 어린 생쥐의 Giardia 감염은 IL-17A 반응을 활성화하여 보호 효과를 발휘하지 못하는 것으로 보고되어 [52] 연구자들은 다른 면역 조절성 Giardia를 찾게 되었습니다.기생충 감염 메커니즘.최근 연구의 저자는 G. muris가 E. coli EPEC에 의해 NLRP3 인플라마솜을 활성화할 수 있다고 보고했는데, 이는 항균 펩타이드의 생산을 촉진하고 장내 부착 능력과 영양체 수를 감소시켜 결장의 중증도를 감소시킵니다. 간균으로 인한 질병 [49].NLRP3 인플라마솜은 다양한 질병의 발병에 관여합니다.연구에 따르면 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 세포 사멸을 피하기 위해 대식세포에서 자가포식을 유발하며, 이 과정은 NLRP3 염증복합체의 활성화에 달려 있습니다[53].N. caninum의 경우, NLRP3 inflammasome의 활성 산소종 매개 활성화는 숙주에서의 복제를 제한하여 잠재적인 치료 표적이 됩니다[9].Paracoccidioides brasiliensis는 마우스 골수 유래 수지상 세포에서 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 유도하여 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 염증성 사이토카인 IL-1β를 방출하는 것으로 밝혀졌습니다[10].L. amazonensis, L. major, L. braziliensis 및 L. infantum chagasi를 포함한 여러 Leishmania 종은 Leishmania 감염뿐만 아니라 대식세포에서 NLRP3 및 ASC 의존성 카스파제-1을 활성화합니다.기생충 복제는 NLRP3/ASC/caspase-1 유전자가 결핍된 쥐에서 강화됩니다[11].Zamboniet al.레슈마니아 감염은 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 유도하여 세포내 기생충 복제를 제한하는 것으로 보고되었습니다.따라서 리슈마니아는 회피 전략으로 NLRP3 활성화를 억제할 수 있습니다.생체 내 연구에서 NLRP3 인플라마좀은 레슈마니아 제거에 기여했지만 조직에는 영향을 미치지 않았습니다[54].반대로, 연충증 연구에서 NLRP3 염증복합체의 활성화는 위장관 연충증에 대한 숙주의 보호 면역을 억제했습니다[12].이질균은 전 세계적으로 설사를 일으키는 주요 박테리아 중 하나입니다.이들 박테리아는 P2X7 수용체 매개 K+ 유출, 활성 산소종, 리소좀 산성화 및 미토콘드리아 손상을 통해 IL-1β 생산을 유도할 수 있습니다.NLRP3 inflammasome은 Shigella에 대한 대식세포의 식세포작용과 살균 활성을 부정적으로 조절합니다.Plasmodium 연구에서는 Plasmodium에 감염된 AIM2, NLRP3 또는 caspase-1 결핍 마우스가 높은 수준의 1형 인터페론을 생산하고 Plasmodium 감염에 대한 저항성이 더 높은 것으로 나타났습니다.그러나 생쥐에서 NLRP3 염증의 병원성 활성화를 유도하는 데 있어 알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아르딘의 역할은 불분명합니다.
이 연구에서, MCC950에 의한 NLRP3 인플라마솜의 억제는 BW를 감소시키고 생쥐의 장 세척액 내 영양체의 수를 증가시켜 십이지장 조직의 더 심각한 병리학적 변화를 초래했습니다.알파-2 지아르딘과 알파-7.3 지아르딘은 숙주 마우스 NLRP3 염증복합체를 활성화하고, 마우스 체중을 증가시키며, 장 세척액 내 영양체 수를 감소시키고, 병리학적 십이지장 병변을 완화시킵니다.이러한 결과는 G. duodenalis가 알파-2 지아르딘과 알파-7,3 지아르딘을 통해 NLRP3 숙주 인플라마솜을 활성화하여 생쥐에서 G. duodenalis의 병원성을 감소시킬 수 있음을 시사합니다.
종합적으로, 우리의 결과는 알파-2와 알파-7.3 지아딘이 NLRP3 숙주 인플라마좀의 활성화를 유도하고 생쥐에서 G. duodenalis의 감염성을 감소시킨다는 것을 보여줍니다.따라서 이들 분자는 편모충증 예방을 위한 유망한 표적입니다.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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