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말초 폐 전달은 치료 효과가 없기 때문에 폐낭성 섬유증 치료를 위한 유전자 벡터는 전도성 기도를 표적으로 삼아야 합니다.바이러스 형질도입의 효율성은 운반체의 체류 시간과 직접적인 관련이 있습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 전달액은 흡입 시 자연적으로 폐포로 확산되며, 어떤 형태의 치료 입자도 점액섬모 수송에 의해 빠르게 제거됩니다.기도 내 유전자 운반체의 체류 시간을 연장하는 것은 중요하지만 달성하기 어렵습니다.호흡기 표면으로 향할 수 있는 캐리어 결합 자성 입자는 지역 타겟팅을 향상시킬 수 있습니다.생체 내 영상화의 문제로 인해, 자기장이 가해질 때 기도 표면에 있는 이러한 작은 자성 입자의 거동은 제대로 이해되지 않습니다.이 연구의 목적은 생체 내에서 단일 및 벌크 입자의 역학 및 행동 패턴을 연구하기 위해 싱크로트론 이미징을 사용하여 마취된 쥐의 기관에서 일련의 자성 입자의 움직임을 생체 내에서 시각화하는 것이었습니다.그런 다음 우리는 자기장이 있는 상태에서 렌티바이러스 자기 입자를 전달하면 쥐 기관에서 형질도입 효율이 증가하는지 여부도 평가했습니다.싱크로트론 X선 영상은 시험관 내 및 생체 내 고정 및 이동 자기장에서 자성 입자의 거동을 보여줍니다.자석을 사용하여 입자를 생체 기도 표면을 가로질러 쉽게 끌 수는 없지만 운반 중에 자기장이 가장 강한 시야에 침전물이 집중됩니다.렌티바이러스 자성 입자가 자기장이 있는 상태에서 전달될 때 변환 효율도 6배 증가했습니다.종합적으로 말하자면, 이러한 결과는 렌티바이러스 자성 입자 및 자기장이 생체 내 전도성 기도에서 유전자 벡터 표적화 및 형질도입 수준을 향상시키는 귀중한 접근법일 수 있음을 시사합니다.
낭포성 섬유증(CF)은 CF 막횡단 전도도 조절자(CFTR)라고 불리는 단일 유전자의 변이로 인해 발생합니다.CFTR 단백질은 낭포성 섬유증 발병의 주요 부위인 기도를 포함하여 신체 전체의 많은 상피 세포에 존재하는 이온 채널입니다.CFTR의 결함은 비정상적인 물 수송, 기도 표면의 탈수 및 기도 표면 유체층(ASL) 깊이 감소로 이어집니다.또한 흡입된 입자와 병원균을 기도에서 제거하는 점액섬모 수송(MCT) 시스템의 능력을 손상시킵니다.우리의 목표는 CFTR 유전자의 정확한 사본을 전달하고 ASL, MCT 및 폐 건강을 개선하기 위한 렌티바이러스(LV) 유전자 치료법을 개발하고 생체 내에서 이러한 매개변수를 측정할 수 있는 새로운 기술을 계속 개발하는 것입니다1.
LV 벡터는 낭포성 섬유증 유전자 치료의 주요 후보 중 하나인데, 이는 주로 치료 유전자를 기도 기저 세포(기도 줄기 세포)에 영구적으로 통합할 수 있기 때문입니다.이는 낭포성 섬유증과 관련된 기능적 유전자 교정 기도 표면 세포로 분화하여 정상적인 수화 및 점액 제거를 회복하여 평생 혜택을 누릴 수 있기 때문에 중요합니다.LV 벡터는 CF의 폐 침범이 시작되는 전도성 기도를 향해야 합니다.벡터를 폐 깊숙히 전달하면 폐포 형질도입이 발생할 수 있지만 이는 낭포성 섬유증에 치료 효과가 없습니다.그러나 유전자 운반체와 같은 체액은 출산 후 흡입될 때 자연적으로 폐포로 이동하고3,4 치료 입자는 MCT에 의해 구강으로 빠르게 배출됩니다.LV 형질도입의 효율성은 벡터가 세포 흡수를 허용하기 위해 표적 세포에 가깝게 유지되는 시간 길이와 직접적인 관련이 있습니다. 이는 점액 및 MCT 입자의 조정된 흡수뿐만 아니라 일반적인 지역 공기 흐름에 의해 쉽게 단축되는 "체류 시간"입니다.낭포성 섬유증의 경우, 기도 내 좌심실 체류 시간을 연장하는 능력은 이 영역에서 높은 수준의 형질도입을 달성하는 데 중요하지만 지금까지는 어려운 일이었습니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해 우리는 LV 자성 입자(MP)가 두 가지 보완적인 방식으로 도움이 될 수 있다고 제안합니다.첫째, 자석에 의해 기도 표면으로 유도되어 표적화를 개선하고 유전자 운반체 입자가 기도의 올바른 영역에 위치하도록 도울 수 있습니다.및 ASL) 세포층 6으로 이동합니다. MP는 세포막에 부착되거나 각각의 세포 표면 수용체에 결합하고 종양 부위에 축적되는 항체, 화학요법 약물 또는 기타 소분자와 결합할 때 표적 약물 전달 수단으로 널리 사용됩니다. 정전기의 존재.암 치료를 위한 자기장 7. 다른 "고열" 방법은 진동 자기장에 노출될 때 MP를 가열하여 종양 세포를 죽이는 것을 목표로 합니다.자기장을 형질감염제로 사용하여 세포 내로 DNA의 전달을 향상시키는 자기 형질감염의 원리는 형질도입이 어려운 세포주에 대해 다양한 비바이러스 및 바이러스 유전자 벡터를 사용하여 시험관 내에서 일반적으로 사용됩니다. ..정자기장이 있는 상태에서 인간 기관지 상피의 세포주로 시험관 내에서 LV MP를 전달하는 LV 자기 형질감염의 효율성이 확립되었으며, 이는 LV 벡터 단독에 비해 형질도입 효율을 186배 증가시켰습니다.LV MT는 또한 낭포성 섬유증의 체외 모델에 적용되었으며, 여기서 자기 형질감염은 낭포성 섬유증 가래가 있는 경우 공기-액체 인터페이스 배양에서 LV 변환을 20배 증가시켰습니다.그러나 생체 내 장기 자기 형질감염은 비교적 적은 관심을 받았으며 특히 폐에서 소수의 동물 연구11,12,13,14,15에서만 평가되었습니다.그러나 낭포성 섬유증의 폐 치료에서 자기 형질감염 가능성은 분명합니다.Tanet al.(2020)은 "자성 나노입자의 효과적인 폐 전달에 대한 검증 연구는 낭포성 섬유증 환자의 임상 결과를 개선하기 위한 향후 CFTR 흡입 전략의 길을 열어줄 것"이라고 밝혔습니다.
자기장이 가해질 때 기도 표면에 있는 작은 자성 입자의 거동은 시각화하고 연구하기 어렵기 때문에 잘 이해되지 않습니다.다른 연구에서 우리는 가스 채널 표면 수화를 직접 측정하기 위해 ASL18 깊이 및 MCT19 행동의 미세한 생체 내 변화를 비침습적으로 이미징하고 정량화하기 위한 싱크로트론 전파 기반 위상차 X선 이미징(PB-PCXI) 방법을 개발했습니다. 초기 치료 효과의 지표로 사용됩니다.또한 당사의 MCT 채점 방법은 PB-PCXI21에서 볼 수 있는 MCT 마커로 알루미나 또는 고굴절률 유리로 구성된 직경 10~35μm의 입자를 사용합니다.두 방법 모두 MP를 포함한 다양한 입자 유형을 이미징하는 데 적합합니다.
높은 공간적 및 시간적 분해능으로 인해 당사의 PB-PCXI 기반 ASL 및 MCT 분석은 생체 내 단일 및 벌크 입자의 역학 및 행동 패턴을 연구하여 MP 유전자 전달 방법을 이해하고 최적화하는 데 매우 적합합니다.여기서 사용하는 접근 방식은 SPring-8 BL20B2 빔라인을 사용한 연구를 기반으로 합니다. 여기서는 관찰된 이종 유전자 발현 패턴을 설명하는 데 도움이 되도록 마우스의 비강 및 폐 기도에 더미 벡터를 전달한 후 유체 이동을 시각화했습니다. 우리 유전자에.3.4의 담체 용량을 사용한 동물 연구.
이 연구의 목적은 PB-PCXI 싱크로트론을 사용하여 살아있는 쥐의 기관에서 일련의 MP의 생체 내 움직임을 시각화하는 것이었습니다.이러한 PB-PCXI 이미징 연구는 MP 시리즈, 자기장 강도 및 위치를 테스트하여 MP 이동에 미치는 영향을 확인하도록 설계되었습니다.우리는 외부 자기장이 전달된 MF가 목표 영역에 머물거나 이동하는 데 도움이 될 것이라고 가정했습니다.또한 이러한 연구를 통해 우리는 증착 후 기관에 남아 있는 입자의 양을 최대화하는 자석 구성을 결정할 수 있었습니다.두 번째 일련의 연구에서 우리는 기도 표적화의 맥락에서 LV-MP의 전달이 LV 전달 효율이 증가했습니다..
모든 동물 연구는 애들레이드 대학교(M-2019-060 및 M-2020-022)와 SPring-8 싱크로트론 동물 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.실험은 ARRIVE의 권장 사항에 따라 수행되었습니다.
모든 X선 이미지는 이전에 설명한 것과 유사한 설정을 사용하여 일본의 SPring-8 싱크로트론의 BL20XU 빔라인에서 촬영되었습니다.간단히 말해서, 실험 상자는 싱크로트론 저장 링에서 245m 떨어진 곳에 위치했습니다.0.6m의 샘플-검출기 거리가 입자 이미징 연구에 사용되며 생체 내 이미징 연구에 0.3m가 위상차 효과를 생성하는 데 사용됩니다.25keV의 에너지를 갖는 단색 빔이 사용되었습니다.이미지는 sCMOS 검출기에 연결된 고해상도 X선 변환기(SPring-8 BM3)를 사용하여 획득되었습니다.변환기는 10μm 두께의 신틸레이터(Gd3Al2Ga3O12)를 사용하여 X선을 가시광선으로 변환한 후 ×10(NA 0.3) 현미경 대물렌즈를 사용하여 sCMOS 센서로 전달됩니다.sCMOS 검출기는 어레이 크기가 2048 x 2048 픽셀이고 원시 픽셀 크기가 6.5 x 6.5 μm인 Orca-Flash4.0(일본 Hamamatsu Photonics)이었습니다.이 설정은 0.51μm의 유효 등방성 픽셀 크기와 약 1.1mm × 1.1mm의 시야를 제공합니다.호흡으로 인한 운동 인공물을 최소화하면서 기도 내부 및 외부 자성 입자의 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 100ms의 노출 기간이 선택되었습니다.생체 내 연구에서는 노출 사이에 X선 빔을 차단하여 방사선량을 제한하기 위해 X선 경로에 고속 X선 셔터를 배치했습니다.
BL20XU 이미징 챔버는 생물안전성 레벨 2 인증을 받지 않았기 때문에 LV 미디어는 SPring-8 PB-PCXI 이미징 연구에 사용되지 않았습니다.대신, 우리는 다양한 크기, 재료, 철 농도 및 응용 분야를 다루는 두 개의 상용 공급업체로부터 특성이 잘 알려진 다양한 MP를 선택했습니다. 먼저 자기장이 유리 모세관에서 MP의 움직임에 어떻게 영향을 미치는지 이해하고 다음으로 살아있는 기도.표면.MP의 크기는 0.25에서 18 µm까지 다양하며 다양한 재료로 만들어지지만(표 1 참조) MP에 포함된 자성 입자의 크기를 포함한 각 샘플의 구성은 알려져 있지 않습니다.광범위한 MCT 연구 19, 20, 21, 23, 24를 기반으로 MP 움직임의 향상된 가시성을 확인하기 위해 연속 프레임을 빼는 등 기관 기도 표면에서 최소 5μm의 MP를 볼 수 있을 것으로 기대합니다.0.25 µm의 단일 MP는 이미징 장치의 해상도보다 작지만 PB-PCXI는 용적 대비와 증착 후 증착된 표면 액체의 움직임을 감지할 것으로 예상됩니다.
표의 각 MP에 대한 샘플입니다.1은 내부 직경이 0.63mm인 20μl 유리 모세관(Drummond Microcaps, PA, USA)에서 준비되었습니다.미립자 입자는 물에서 사용할 수 있는 반면, CombiMag 입자는 제조업체의 독점 액체에서 사용할 수 있습니다.각 튜브는 액체(약 11μl)로 반쯤 채워져 샘플 홀더에 배치됩니다(그림 1 참조).유리 모세관은 각각 이미징 챔버의 스테이지에 수평으로 배치되었으며 액체의 가장자리에 위치했습니다.1.17T의 잔류성을 갖는 희토류, 네오디뮴, 철 및 붕소(NdFeB)(N35, 카탈로그 번호 LM1652, Jaycar Electronics, Australia)로 만들어진 직경 19mm(길이 28mm) 니켈 쉘 자석을 별도의 전송 테이블을 통해 렌더링 중에 위치를 원격으로 변경할 수 있습니다.X선 이미징은 자석이 샘플 위 약 30mm 위치에 있을 때 시작되며 이미지는 초당 4프레임으로 획득됩니다.이미징 중에 자석을 유리 모세관에 가까이 가져간 다음(약 1mm 거리) 튜브를 따라 이동하여 전계 강도와 위치의 영향을 평가했습니다.
xy 샘플의 이동 단계에서 유리 모세관에 MP 샘플을 포함하는 시험관 내 이미징 설정입니다.X선 빔의 경로는 빨간색 점선으로 표시됩니다.
MP의 시험관 내 가시성이 확립되면 야생형 암컷 Wistar 알비노 쥐(~12주령, ~200g)를 대상으로 MP의 하위 집합을 생체 내에서 테스트했습니다.메데토미딘 0.24mg/kg(Domitor®, Zenoaq, 일본), 미다졸람 3.2mg/kg(Dormicum®, Astellas Pharma, 일본) 및 부토르파놀 4mg/kg(Vetorphale®, Meiji Seika).쥐를 Pharma(일본) 혼합물로 복강내 주사하여 마취시켰습니다.마취 후 기관 주변의 털을 제거하고 기관내관(ET; 16 Ga 정맥 캐뉼라, Terumo BCT)을 삽입한 후 열 백이 포함된 맞춤형 영상 플레이트에 바로 누운 자세로 고정하여 영상 촬영을 준비했습니다. 체온을 유지하기 위해.22. 그림 2a에 표시된 대로 이미징 플레이트를 이미징 상자의 샘플 스테이지에 약간의 각도로 부착하여 X선 이미지에서 기관을 수평으로 정렬했습니다.
(a) SPring-8 이미징 장치의 생체 내 이미징 설정, 빨간색 점선으로 표시된 X선 빔 경로.(b,c) 기관 자석 위치 파악은 직각으로 장착된 두 대의 IP 카메라를 사용하여 원격으로 수행되었습니다.화면의 이미지 왼쪽에는 머리를 고정하는 와이어 루프와 ET 튜브 내부에 설치된 전달 캐뉼라가 보입니다.
100μl 유리 주사기를 사용하는 원격 제어 주사기 펌프 시스템(UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL)을 30Ga 바늘을 사용하여 PE10 튜브(0.61mm OD, 0.28mm ID)에 연결했습니다.기관내 튜브를 삽입할 때 팁이 기관의 올바른 위치에 있는지 확인하기 위해 튜브에 표시를 하십시오.마이크로 펌프를 사용하여 주사기 플런저를 제거하고 튜브 끝을 MP 샘플에 담가 전달했습니다.그런 다음 로드된 전달 튜브를 기관내 튜브에 삽입하여 예상되는 적용 자기장의 가장 강한 부분에 팁을 배치했습니다.이미지 획득은 Arduino 기반 타이밍 박스에 연결된 호흡 감지기를 사용하여 제어되었으며 모든 신호(예: 온도, 호흡, 셔터 열기/닫기 및 이미지 획득)는 Powerlab 및 LabChart(AD Instruments, Sydney, Australia)를 사용하여 기록되었습니다. 22 이미징 시 하우징을 사용할 수 없는 경우 두 대의 IP 카메라(Panasonic BB-SC382)를 서로 약 90°로 배치하고 이미징 중에 기관을 기준으로 자석의 위치를 ​​제어하는 ​​데 사용했습니다(그림 2b, c).운동 인공물을 최소화하기 위해 말기 호흡 흐름 고원 동안 호흡당 하나의 이미지를 획득했습니다.
자석은 이미징 본체 외부에 원격으로 위치할 수 있는 두 번째 스테이지에 부착됩니다.다음을 포함하여 자석의 다양한 위치와 구성이 테스트되었습니다. 기관 위에서 약 30° 각도로 배치됨(구성은 그림 2a 및 3a에 표시됨);하나의 자석은 동물 위에 있고 다른 하나는 아래에 있으며, 극은 인력을 위해 설정되어 있습니다(그림 3b)., 반발을 위해 극이 설정된 동물 위와 아래에 하나의 자석, 기관 위와 수직인 하나의 자석(그림 3d).동물과 자석을 설정하고 테스트 중인 MP를 주사기 펌프에 로드한 후 이미지 획득 시 4 μl/sec의 속도로 50 μl의 용량을 전달합니다.그런 다음 자석은 계속해서 이미지를 획득하면서 기관을 따라 또는 가로질러 앞뒤로 움직입니다.
생체 내 이미징을 위한 자석 구성 (a) 약 30° 각도로 기관 위에 자석 1개, (b) 인력용으로 구성된 자석 2개, (c) 반발용으로 구성된 자석 2개, (d) 기관 위에 수직으로 있는 자석 1개 기관.관찰자는 기관을 통해 입에서 폐까지 내려다보았으며, X선 빔은 쥐의 왼쪽을 통과하여 오른쪽으로 빠져나갔다.자석은 기도의 길이를 따라 이동하거나 X선 빔 방향으로 기관 위에서 왼쪽 및 오른쪽으로 이동합니다.
우리는 또한 호흡과 심박수가 혼합되지 않은 상태에서 기도 내 입자의 가시성과 거동을 확인하려고 했습니다.따라서 영상 촬영 기간이 끝나면 펜토바르비탈 과다 복용으로 인해 동물을 인도적으로 안락사시켰습니다(Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).일부 동물은 이미징 플랫폼에 남겨두고 호흡과 심장 박동이 멈춘 후 이미징 과정을 반복하여 기도 표면에 MP가 보이지 않는 경우 MP의 추가 선량을 추가했습니다.
결과 이미지는 평면 및 암시야에 대해 보정된 다음 MATLAB(R2020a, The Mathworks)으로 작성된 사용자 지정 스크립트를 사용하여 영화(초당 20프레임, 호흡률에 따라 15~25×정상 속도)로 조합되었습니다.
LV 유전자 벡터 전달에 대한 모든 연구는 애들레이드 대학교 실험실 동물 연구 센터에서 수행되었으며 SPring-8 실험 결과를 사용하여 자기장이 있는 상태에서 LV-MP 전달이 생체 내 유전자 전달을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하는 것을 목표로 했습니다. .MF와 자기장의 영향을 평가하기 위해 두 그룹의 동물을 치료했습니다. 한 그룹에는 자석이 배치된 LV MF가 주입되었고, 다른 그룹에는 자석이 없는 LV MF가 주입되었습니다.
LV 유전자 벡터는 이전에 설명한 방법 25, 26을 사용하여 생성되었습니다.LacZ 벡터는 MPSV 구성 프로모터(LV-LacZ)에 의해 구동되는 핵 국소 베타-갈락토시다제 유전자를 발현하며, 이는 형질도입된 세포에서 파란색 반응 생성물을 생성하며 폐 조직의 앞부분과 단면에서 볼 수 있습니다.TU/ml 단위의 역가를 계산하기 위해 혈구계를 사용하여 LacZ-양성 세포의 수를 수동으로 계산함으로써 세포 배양물에서 적정을 수행했습니다.운반체는 -80°C에서 냉동 보존되고, 사용하기 전에 해동되고, 1:1로 혼합되고 배송 전 최소 30분 동안 얼음 위에서 배양되어 CombiMag에 결합됩니다.
정상 Sprague Dawley 쥐(n = 그룹당 3마리, 생후 1개월에 0.4mg/kg 메데토미딘(Domitor, Ilium, Australia) 및 60mg/kg 케타민(Ilium, Australia)의 혼합물로 복강내 마취된 약 2~3마리) 복강내 ) 16 Ga 정맥 캐뉼라를 이용한 주사 및 비수술적 경구 캐뉼러 삽입.기관 기도 조직이 LV 변환을 받도록 하기 위해 기관 기도 표면을 와이어 바구니(N-Circle, 팁이 없는 니티놀 스톤 추출기 NTSE-022115) -UDH로 축 방향으로 문지르는 이전에 설명한 기계적 섭동 프로토콜을 사용하여 조절했습니다. Cook Medical, 미국) 30p28.이후 biosafety Cabinet 내 교란 후 약 10분 후에 LV-MP의 기관투여를 실시하였다.
이 실험에 사용된 자기장은 생체 내 X선 연구와 유사하게 구성되었으며, 증류 스텐트 클램프를 사용하여 동일한 자석을 기관 위에 고정했습니다(그림 4).LV-MP의 50 μl 부피(2 x 25 μl 분취량)를 이전에 설명한 대로 젤 팁 피펫을 사용하여 기관(n = 3 동물)으로 전달했습니다.대조군(n=3마리 동물)은 자석을 사용하지 않고 동일한 LV-MP를 받았습니다.주입이 완료된 후 기관내관에서 캐뉼라를 제거하고 동물의 관을 삽관합니다.자석은 제거되기 전에 10분 동안 제자리에 남아 있습니다.쥐에게 멜록시캄(1 ml/kg)(호주 Ilium)을 피하 투여한 후 1 mg/kg 아티파마졸 염산염(Antisedan, Zoetis, 호주)을 복강내 주사하여 마취를 중단했습니다.쥐를 따뜻하게 유지하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 관찰했습니다.
생물학적 안전 캐비닛의 LV-MP 전달 장치.ET 튜브의 연한 회색 루어락 슬리브가 입 밖으로 돌출되어 있고, 그림에 표시된 젤 피펫 팁이 ET 튜브를 통해 기관 내 원하는 깊이까지 삽입되는 것을 볼 수 있습니다.
LV-MP 투여 절차 1주일 후, 동물은 100% CO2를 흡입하여 인도적으로 희생되었으며 LacZ 발현은 표준 X-gal 처리를 사용하여 평가되었습니다.기관 내 튜브 배치로 인한 기계적 손상이나 체액 유지가 분석에 포함되지 않도록 가장 꼬리 부분에 있는 세 개의 연골 고리를 제거했습니다.각 기관을 세로로 절단하여 분석용 두 개의 반쪽을 얻고 Minutien 바늘(Fine Science Tools)을 사용하여 실리콘 고무(Sylgard, Dow Inc)가 들어 있는 컵에 넣어 관강 표면을 시각화했습니다.형질도입된 세포의 분포와 특성은 Nikon 현미경(SMZ1500)과 DigiLite 카메라 및 TCapture 소프트웨어(Tucsen Photonics, China)를 사용한 정면 사진 촬영을 통해 확인되었습니다.이미지는 20x 배율(기관의 전체 너비에 대한 최대 설정 포함)로 획득되었으며, 기관의 전체 길이가 단계별로 표시되어 이미지를 "스티칭"할 수 있도록 각 이미지 간에 충분한 중첩을 제공했습니다.그런 다음 평면 모션 알고리즘을 사용하는 Composite Image Editor 버전 2.0.3(Microsoft Research)을 사용하여 각 기관의 이미지를 단일 합성 이미지로 결합했습니다. 각 동물의 기관 복합 이미지 내 LacZ 발현 영역은 0.35 < Hue < 0.58, 채도 > 0.15 및 값 < 0.7 설정을 사용하여 이전에 설명한 대로 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화되었습니다. 각 동물의 기관 합성 이미지 내 LacZ 발현 영역은 0.35 < Hue < 0.58, 채도 > 0.15 및 값 < 0.7 설정을 사용하여 이전에 설명한 대로 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화되었습니다. LacZ는 составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, 0,15 및 значение <0 ,7. 각 동물의 복합 기관 이미지에서 LacZ 발현 영역은 0.35의 설정을 사용하여 이전에 설명한 대로 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화되었습니다.0.15 및 값<0.7.如前所述，使use自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动식물적气管复同图 Image中的LacZ 表达区域进行weightization，使用0.35 < color调< 0.58、饱和각도> 0.15와 < 0.7의 차이.이전에 述 , 自动 自动 Matlab 脚本 （(r2020a , Mathworks) 来自 每 只 的 气管 复同 图 Image 적 적 적 表达 량화 , 使用 使用 使用 0.35 <color调 <0.58 、> 0.15 와 <0.7 의 。。。 ．。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого количественно определяли с использованиема тизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыЂенность> 0,15 зн 시간 <0,7 . 각 동물 기관의 합성 이미지에서 LacZ 발현 영역은 0.35 < 색조 < 0.58, 채도 > 0.15 및 값 < 0.7 설정을 사용하여 이전에 설명한 대로 자동화된 MATLAB 스크립트(R2020a, MathWorks)를 사용하여 정량화되었습니다.GIMP v2.10.24에서 조직 윤곽을 추적함으로써 각 합성 이미지에 대해 마스크를 수동으로 생성하여 조직 영역을 식별하고 기관 조직 외부의 잘못된 감지를 방지했습니다.각 동물의 모든 합성 이미지에서 염색된 영역을 합산하여 해당 동물의 총 염색된 영역을 제공했습니다.그런 다음 칠해진 영역을 마스크의 전체 영역으로 나누어 표준화된 영역을 얻었습니다.
각 기관은 파라핀에 묻혀 있고 5μm 두께로 절단되었습니다.섹션을 5분 동안 Neutral Fast Red로 대조염색하고 Nikon Eclipse E400 현미경, DS-Fi3 카메라 및 NIS 요소 캡처 소프트웨어(버전 5.20.00)를 사용하여 이미지를 획득했습니다.
모든 통계 분석은 GraphPad Prism v9(GraphPad Software, Inc.)에서 수행되었습니다.통계적 유의성은 p ≤ 0.05로 설정되었습니다.Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정상성을 테스트하고 LacZ 염색의 차이는 unpaired t-test를 사용하여 평가했습니다.
표 1에 설명된 6개의 MP는 PCXI로 검사되었으며 가시성은 표 2에 설명되어 있습니다. 두 개의 폴리스티렌 MP(MP1 및 MP2, 각각 18μm 및 0.25μm)는 PCXI로 표시되지 않았지만 나머지 샘플은 식별할 수 있습니다. (예는 그림 5에 나와 있습니다).MP3 및 MP4는 약하게 보입니다(10-15% Fe3O4, 각각 0.25μm 및 0.9μm).MP5(98% Fe3O4, 0.25 µm)에는 테스트된 가장 작은 입자가 일부 포함되어 있지만 가장 두드러졌습니다.CombiMag MP6 제품은 구별이 어렵습니다.모든 경우에 자석을 모세관과 평행하게 앞뒤로 움직여 MF를 감지하는 능력이 크게 향상되었습니다.자석이 모세관에서 멀어짐에 따라 입자는 긴 사슬로 당겨졌지만 자석이 접근하고 자기장 강도가 증가함에 따라 입자가 모세관의 상부 표면쪽으로 이동함에 따라 입자 사슬이 짧아졌습니다 (보충 비디오 S1 참조) : MP4), 표면의 입자 밀도를 증가시킵니다.반대로, 자석이 모세관에서 제거되면 전계 강도가 감소하고 MP가 모세관의 상부 표면에서 연장되는 긴 사슬로 재배열됩니다(보충 비디오 S2: MP4 참조).자석의 움직임이 멈춘 후에도 입자는 평형 위치에 도달한 후에도 일정 시간 동안 계속 움직입니다.MP가 모세관의 상부 표면을 향해 이동하거나 멀어짐에 따라 자성 입자가 액체를 통해 잔해물을 끌어들이는 경향이 있습니다.
PCXI에서 MP의 가시성은 샘플마다 상당히 다릅니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6.여기에 표시된 모든 이미지는 모세관 바로 위에 약 10mm 위치에 있는 자석을 사용하여 촬영되었습니다.겉보기에 큰 원은 모세혈관에 갇힌 기포로, 위상차 이미지의 흑백 가장자리 특징을 명확하게 보여줍니다.빨간색 상자는 대비를 강화하는 배율을 나타냅니다.모든 그림에 있는 자석 회로의 직경은 실제 비율에 따른 것이 아니며 표시된 것보다 약 100배 더 큽니다.
자석이 모세관 상단을 따라 왼쪽과 오른쪽으로 움직이면 MP 스트링의 각도가 자석과 정렬되도록 변경되어(그림 6 참조) 자기장 선의 윤곽이 그려집니다.MP3-5의 경우 현이 임계각에 도달한 후 입자가 모세관의 상부 표면을 따라 끌립니다.이로 인해 MP가 자기장이 가장 강한 곳 근처의 더 큰 그룹으로 클러스터링되는 경우가 많습니다(보충 비디오 S3: MP5 참조).이는 모세관 끝 가까이에서 이미징할 때 특히 두드러지며, 이로 인해 MP가 액체-공기 인터페이스에 응집되고 집중됩니다.MP3-5의 입자보다 구별하기 어려운 MP6의 입자는 자석이 모세관을 따라 이동할 때 끌리지 않았지만 MP 스트링이 해리되어 입자가 보이는 상태로 유지되었습니다(보충 비디오 S4: MP6 참조).어떤 경우에는 이미징 사이트에서 자석을 먼 거리로 이동하여 적용된 자기장이 줄어들면 나머지 MP는 중력에 의해 튜브 바닥 표면으로 천천히 내려가 스트링에 남아 있습니다(보충 비디오 S5: MP3 참조). .
MP 스트링의 각도는 자석이 모세관 위에서 오른쪽으로 이동함에 따라 변경됩니다.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 및 (d) MP6.빨간색 상자는 대비를 강화하는 배율을 나타냅니다.추가 비디오는 이러한 정적 이미지에서 시각화할 수 없는 중요한 입자 구조와 동적 정보를 보여주기 때문에 정보 제공 목적으로 제공됩니다.
우리의 테스트는 기관을 따라 천천히 앞뒤로 자석을 움직이는 것이 생체 내 복잡한 움직임의 맥락에서 MF의 시각화를 용이하게 한다는 것을 보여주었습니다.폴리스티렌 비드(MP1 및 MP2)가 모세관에서 보이지 않았기 때문에 생체 내 테스트는 수행되지 않았습니다.나머지 4개의 MF 각각은 수직에 대해 약 30° 각도로 기관 위에 자석의 장축을 배치하여 생체 내에서 테스트되었습니다(그림 2b 및 3a 참조). 이로 인해 MF 사슬이 더 길어지고 더 효과적이었습니다. 자석보다..구성이 종료되었습니다.MP3, MP4 및 MP6는 살아있는 동물의 기관에서 발견되지 않았습니다.동물을 인도적으로 죽인 후 쥐의 호흡기관을 시각화한 결과, 주사기 펌프를 사용하여 추가 용량을 추가해도 입자가 보이지 않는 상태로 유지되었습니다.MP5는 산화철 함량이 가장 높고 눈에 보이는 유일한 입자이므로 생체 내 MP 거동을 평가하고 특성화하는 데 사용되었습니다.
MF 삽입 중에 기관 위에 자석을 배치하면 전부는 아니지만 많은 MF가 시야에 집중됩니다.입자의 기관 진입은 인도적으로 안락사된 동물에서 가장 잘 관찰됩니다.그림 7 및 보충 비디오 S6: MP5는 복부 기관 표면에 있는 입자의 빠른 자기 포착 및 정렬을 보여 주며, 이는 MP가 기관의 원하는 영역을 목표로 삼을 수 있음을 나타냅니다.MF 전달 후 기관을 따라 더 먼 곳을 검색할 때 일부 MF가 분기부 근처에서 발견되었습니다. 이는 수액 투여 중 최대 자기장 강도 영역을 통해 전달되었기 때문에 모든 MF를 수집하고 유지하기에는 자기장 강도가 부족함을 나타냅니다.프로세스.그러나 출생 후 MP 농도는 이미지 영역 주변에서 더 높았으며, 이는 적용된 자기장 강도가 가장 높은 기도 영역에 많은 MP가 남아 있음을 시사합니다.
(a) 이미징 영역 바로 위에 자석을 놓고 최근 안락사시킨 쥐의 기관에 MP5를 전달하기 전과 (b) 후의 이미지.묘사된 영역은 두 개의 연골 고리 사이에 위치합니다.MP가 전달되기 전에 기도에 약간의 체액이 있습니다.빨간색 상자는 대비를 강화하는 배율을 나타냅니다.이 이미지는 S6: MP5 보충 비디오에 포함된 비디오에서 가져온 것입니다.
생체 내에서 기관을 따라 자석을 이동하면 모세혈관에서 관찰된 것과 유사하게 기도 표면의 MP 체인 각도가 변경되었습니다(그림 8 및 보충 비디오 S7: MP5 참조).그러나 우리 연구에서 MP는 모세혈관처럼 살아있는 호흡기 표면을 따라 끌 수 없었습니다.어떤 경우에는 자석이 좌우로 움직이면서 MP 체인이 길어집니다.흥미롭게도 우리는 자석이 기관을 따라 세로로 움직일 때 입자 사슬이 유체 표면층의 깊이를 변화시키고, 자석이 바로 머리 위로 움직이고 입자 사슬이 수직 위치로 회전할 때 팽창한다는 것을 발견했습니다. 보충 비디오 S7).: 0:09의 MP5, 오른쪽 하단).자석이 기관 상단을 가로질러 측면으로 움직일 때(즉, 기관 길이를 따라가 아니라 동물의 왼쪽이나 오른쪽으로) 특징적인 움직임 패턴이 변경되었습니다.입자는 움직이는 동안에도 여전히 선명하게 보였지만 기관에서 자석을 제거하면 입자 끈의 끝이 보입니다(보조 비디오 S8: MP5 참조, 0:08부터 시작).이는 유리 모세관에 적용된 자기장의 작용 하에서 관찰된 자기장의 거동과 일치합니다.
살아있는 마취된 쥐의 기관에 있는 MP5를 보여주는 샘플 이미지.(a) 자석은 기관의 위와 왼쪽에 있는 이미지를 획득하는 데 사용되며, 그런 다음 (b) 자석을 오른쪽으로 이동한 후.빨간색 상자는 대비를 강화하는 배율을 나타냅니다.이 이미지는 S7의 보충 비디오: MP5에 포함된 비디오에서 가져온 것입니다.
두 극이 기관 위와 아래에서 남북 방향으로 조정되면(즉, 유인, 그림 3b), MP 코드는 더 길게 나타나고 기관의 등쪽 표면이 아닌 기관의 측면 벽에 위치합니다. 기관(부록 참조).비디오 S9:MP5).그러나 일반적으로 단일 자석 장치에서 발생하는 이중 자석 장치를 사용한 수액 투여 후에는 한 부위(즉, 기관의 등쪽 표면)에서 고농도의 입자가 감지되지 않았습니다.그런 다음 하나의 자석이 반대 극을 밀어내도록 구성한 경우(그림 3c) 전달 후 시야에 보이는 입자 수가 증가하지 않았습니다.자석을 각각 끌어당기거나 밀어내는 높은 자기장 강도로 인해 두 개의 자석 구성을 모두 설정하는 것은 어렵습니다.그런 다음 설정은 기도와 평행하지만 기도를 90도 각도로 통과하는 단일 자석으로 변경되어 힘의 선이 기관 벽을 직각으로 교차하도록 했습니다(그림 3d). 이 방향은 입자 응집의 가능성을 결정하기 위한 방향입니다. 측면 벽.관찰되다.그러나 이 구성에서는 식별 가능한 MF 축적 움직임이나 자석 움직임이 없었습니다.이러한 모든 결과를 바탕으로 유전자 운반체에 대한 생체 내 연구를 위해 단일 자석과 30도 방향의 구성이 선택되었습니다 (그림 3a).
동물이 인도적으로 희생된 직후 여러 번 이미지화되었을 때 조직 운동을 방해하지 않는다는 것은 자석의 병진 운동에 따라 '흔들리는' 명확한 연골간 장에서 더 미세하고 짧은 입자 선이 식별될 수 있음을 의미했습니다.MP6 입자의 존재와 움직임을 명확하게 볼 수 있습니다.
LV-LacZ의 역가는 1.8 x 108 IU/mL였으며 CombiMag MP(MP6)와 1:1로 혼합한 후 9 x 107 IU/ml의 LV 비히클(즉, 4.5 x 106 TU/쥐).).).이 연구에서는 노동 중에 자석을 움직이는 대신 자석을 한 위치에 고정하여 좌심실 변환이 (a) 자기장이 없는 벡터 전달에 비해 향상될 수 있는지, 그리고 (b) 기도가 집중하세요.상기도의 자기 표적 영역에서 세포가 형질전환되고 있습니다.
자석의 존재 및 LV 벡터와 결합된 CombiMag의 사용은 표준 LV 벡터 전달 프로토콜과 마찬가지로 동물 건강에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.기계적 섭동을 받은 기관 영역의 정면 이미지(보충 그림 1)는 LV-MP 처리 그룹이 자석이 있는 경우 훨씬 더 높은 수준의 변환을 가짐을 보여주었습니다(그림 9a).대조군에는 소량의 파란색 LacZ 염색만이 존재했습니다(그림 9b).X-Gal로 염색된 표준화된 영역의 정량화는 자기장이 있는 상태에서 LV-MP를 투여하면 약 6배 개선되는 것으로 나타났습니다(그림 9c).
자기장이 있는 경우 및 (b) 자석이 없는 경우 LV-MP(a)를 사용한 기관 변환을 보여주는 합성 이미지의 예.(c) 자석을 사용하여 기관 내 LacZ 변환의 정규화된 영역이 통계적으로 유의미하게 개선되었습니다(*p = 0.029, t-테스트, 그룹당 n = 3, 평균 ± 평균의 표준 오차).
중성 고속 적색 염색 부분(보충 그림 2에 표시된 예)은 LacZ 염색 세포가 이전에 보고된 것과 동일한 샘플 및 동일한 위치에 존재함을 나타냅니다.
기도 유전자 치료의 핵심 과제는 관심 영역에서 담체 입자의 정확한 위치 파악과 기류 및 활성 점액 제거가 있는 상태에서 이동성 폐에서 높은 수준의 전달 효율을 달성하는 것입니다.낭포성 섬유증의 호흡기 질환 치료용 LV 캐리어의 경우, 전도성 기도에서 캐리어 입자의 체류 시간을 늘리는 것은 지금까지 달성할 수 없는 목표였습니다.Castellani 등이 지적한 바와 같이, 형질도입을 향상시키기 위해 자기장을 사용하는 것은 단순성, 경제성, 국소 전달, 증가된 효율성 및 더 짧은 배양 시간을 결합할 수 있기 때문에 전기천공과 같은 다른 유전자 전달 방법에 비해 이점이 있습니다.그리고 아마도 차량의 더 낮은 복용량10.그러나 외부 자기력의 영향으로 기도 내 자성 입자의 생체 내 침착 및 거동은 설명된 적이 없으며 실제로 온전한 살아있는 기도에서 유전자 발현 수준을 증가시키는 이 방법의 능력은 생체 내에서 입증되지 않았습니다.
PCXI 싱크로트론에 대한 시험관 내 실험에서는 MP 폴리스티렌을 제외하고 테스트한 모든 입자가 우리가 사용한 이미징 설정에서 볼 수 있음을 보여주었습니다.자기장이 존재하면 자기장은 끈을 형성하며, 그 길이는 입자의 유형 및 자기장의 강도(즉, 자석의 근접성 및 움직임)와 관련됩니다.그림 10에서 볼 수 있듯이, 우리가 관찰하는 끈은 각 개별 입자가 자화되고 자체적인 국지적 자기장을 유도할 때 형성됩니다.이러한 별도의 필드는 다른 입자의 로컬 인력 및 반발력으로 인한 로컬 힘으로 인해 다른 유사한 입자가 그룹 끈 운동을 수집하고 연결하게 만듭니다.
(a, b) 유체로 채워진 모세혈관 내부에 형성되는 입자 사슬과 (c, d) 공기로 채워진 기관을 보여주는 다이어그램.모세혈관과 기관은 일정한 비율로 그려지지 않았습니다.패널 (a)에는 사슬로 배열된 Fe3O4 입자를 포함하는 MF에 대한 설명도 포함되어 있습니다.
자석이 모세관 위로 이동할 때 입자 끈의 각도는 Fe3O4를 포함하는 MP3-5의 임계 임계값에 도달했으며 그 후 입자 끈은 더 이상 원래 위치에 남아 있지 않고 표면을 따라 새로운 위치로 이동했습니다.자석.이 효과는 유리 모세관의 표면이 이러한 움직임이 발생할 수 있을 만큼 충분히 매끄러우므로 발생합니다.흥미롭게도 MP6(CombiMag)는 이러한 방식으로 거동하지 않았습니다. 아마도 입자가 더 작거나 코팅 또는 표면 전하가 다르거나 독점적인 캐리어 유체가 이동 능력에 영향을 미쳤기 때문일 것입니다.CombiMag 입자 이미지의 대비도 약해 액체와 입자가 동일한 밀도를 가질 수 있으므로 쉽게 서로를 향해 이동할 수 없음을 나타냅니다.자석이 너무 빠르게 움직이면 입자가 끼일 수도 있습니다. 이는 자기장의 강도가 항상 유체 내 입자 사이의 마찰을 극복할 수 없음을 나타내며, 자기장의 강도와 자석과 대상 영역 사이의 거리가 과해져서는 안 됨을 나타냅니다. 놀라다.중요한.이러한 결과는 또한 자석이 목표 영역을 통해 흐르는 많은 미세 입자를 포착할 수 있지만 자석이 기관 표면을 따라 CombiMag 입자를 이동시키는 데 의존할 가능성이 없다는 것을 나타냅니다.따라서 우리는 생체 내 LV MF 연구에서 기도 트리의 특정 영역을 물리적으로 표적으로 삼기 위해 정적 자기장을 사용해야 한다고 결론지었습니다.
입자가 체내로 전달되면 신체의 복잡하게 움직이는 조직의 맥락에서 식별하기가 어렵지만 자석을 기관 위로 수평으로 움직여 MP 스트링을 "흔들기"로 ​​감지 기능이 향상되었습니다.실시간 이미징이 가능하지만 동물이 인도적으로 살해된 후 입자 움직임을 식별하는 것이 더 쉽습니다.MP 농도는 일반적으로 자석이 이미징 영역 위에 위치할 때 이 위치에서 가장 높았지만 일부 입자는 일반적으로 기관 아래에서 더 아래쪽에서 발견되었습니다.시험관 내 연구와 달리 입자는 자석의 움직임에 의해 기관 아래로 끌릴 수 없습니다.이 발견은 기관 표면을 덮고 있는 점액이 일반적으로 흡입된 입자를 처리하여 점액에 가두어 점액 섬모 제거 메커니즘을 통해 제거하는 방법과 일치합니다.
우리는 인력을 위해 기관 위와 아래에 자석을 사용하면(그림 3b) 한 지점에 고도로 집중된 자기장이 아닌 보다 균일한 자기장이 발생하여 잠재적으로 입자가 보다 균일하게 분포될 수 있다는 가설을 세웠습니다..그러나 우리의 예비 연구에서는 이 가설을 뒷받침할 명확한 증거를 찾지 못했습니다.마찬가지로, 한 쌍의 자석을 반발하도록 설정하면(그림 3c) 이미지 영역에 더 많은 입자가 정착되지 않습니다.이 두 가지 발견은 이중 자석 설정이 MP 포인팅의 로컬 제어를 크게 향상시키지 못하고 결과적으로 강한 자기력을 조정하기 어려워 이 접근 방식의 실용성을 떨어뜨린다는 것을 보여줍니다.마찬가지로, 기관 위와 가로질러 자석의 방향을 지정해도(그림 3d) 이미지 영역에 남아 있는 입자의 수가 증가하지 않았습니다.이러한 대체 구성 중 일부는 증착 영역의 자기장 강도를 감소시키기 때문에 성공하지 못할 수 있습니다.따라서 30도 각도의 단일 자석 구성(그림 3a)은 가장 간단하고 효율적인 생체 내 테스트 방법으로 간주됩니다.
LV-MP 연구에서는 LV 벡터를 CombiMag와 결합하고 자기장이 있는 상태에서 물리적으로 교란한 후 전달한 경우 대조군에 비해 기관에서 형질도입 수준이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.싱크로트론 이미징 연구와 LacZ 결과를 바탕으로 자기장은 기관 내 LV를 유지하고 즉시 폐 깊숙이 침투하는 벡터 입자의 수를 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다.이러한 표적화 개선은 전달된 역가, 비표적 형질도입, 염증 및 면역 부작용, 유전자 전달 비용을 줄이면서 효율성을 높일 수 있습니다.중요한 것은 제조업체에 따르면 CombiMag는 다른 바이러스 벡터(예: AAV) 및 핵산을 포함한 다른 유전자 전달 방법과 조합하여 사용할 수 있다는 것입니다.